免疫親和層析法凈化高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素M1
1、范圍
適用于測(cè)定牛奶、奶粉，以及低脂牛奶、脫脂牛奶、低脂奶粉和脫脂奶粉中黃曲霉毒素 M1?的含量。奶粉中的最低檢測(cè)限是0.08μg/kg，牛奶中的最低檢測(cè)限是0.008μg/kg。
2、原理
試樣通過免疫親和柱時(shí)，黃曲霉毒素 M1?被提取。親和柱含有特性的抗體鍵合在固體支持物上。當(dāng)樣品通過親和柱時(shí)，抗體選擇性地與所有存在的黃曲霉毒素 M1（抗原）鍵合，形成抗體抗原復(fù)合體。停留在親和柱上的所有樣品上其他雜質(zhì)用水清洗掉。然后用淋洗液將親和柱上的黃曲霉毒素 M1?洗脫下來(lái)，收集洗脫液。用帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定洗脫液中黃曲霉毒素 M1?含量。
3、試劑
除非特別聲明，所用試劑為分析純，使用蒸餾水、軟化水或其他相當(dāng)純度的水。
（1）免疫親和柱?
免疫親和柱應(yīng)該含有黃曲霉毒素 M1?的抗體。親和柱的最大容量不小于100ng 黃曲霉毒素 M1（相當(dāng)于50mL 濃度為2μg/L 的試樣）、當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液含有4ng 黃曲霉毒素 M1（相當(dāng)于50mL 濃度為80ng/L 的試樣）時(shí)回收率不低于80％。應(yīng)該經(jīng)常檢查親和柱的技術(shù)性能，對(duì)于每個(gè)批次的親和柱至少檢查一次。
a.柱效檢查? 用移液管移取1.0mL 的黃曲霉毒素 M1?儲(chǔ)備液到20mL 的錐形試管中。用恒流的氮?dú)鈱⒁后w慢慢吹干，然后用10mL10％的乙腈溶解干基質(zhì)，用力搖蕩。
將該溶液加入到40mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按要求使用親和柱。淋洗親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1，將洗脫液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用 HPLC 測(cè)定親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1?的含量。
計(jì)算黃曲霉毒素 M1?的回收率，將其結(jié)果與中所要求的指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比。
b.回收率檢查? 用移液管移取0.8mL 0.005μg/mL 的黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)工作液到10mL 的水中，充分混勻，全部通過免疫親和柱。按要求使用親和柱。淋洗親和柱，洗脫下黃曲霉毒素 M1，將洗脫液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，用 HPLC 測(cè)定親和柱鍵合的黃曲霉毒素 M1的含量。計(jì)算黃曲霉毒素 M1?的回收率，將其結(jié)果與①中所要求的指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比。
（2）乙腈：色譜級(jí)。
a.乙腈水溶液（25％，V/V），將250mL 的乙腈與750mL 的水（使用前需要脫氣）混溶。
b.10％的乙腈水溶液（V/V），將100mL 的乙腈與900mL 的水（使用前需要脫氣）混溶。
（3）氮?dú)狻?/span>
（4）氯仿：
加入0.5％～1.0％（m/m）的乙醇中進(jìn)行穩(wěn)定化。
（5）黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液。
a.標(biāo)準(zhǔn)溶液? 黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10μg/mL。根據(jù)下面的方法，在最大吸收波段處測(cè)定溶液的吸光度，以確定黃曲霉毒素 M1?的實(shí)際濃度。
用分光光度計(jì)，在340～370nm 處測(cè)定扣除氯仿的空白本底，讀取標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。在最大吸收波段處，（λmax＝360nm）測(cè)得吸光度值為 A，根據(jù)下列公式計(jì)算出濃度值c1（μg/mL）：
式中A——在?λmax?處測(cè)得的吸光度值。
M——328g/mol，黃曲霉毒素M1摩爾質(zhì)量，g/mol；
m——1995m2/mol，溶于氯仿中的黃曲霉毒素 M1?的吸光系數(shù)，m2/mol。
b.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液? 確定標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度值后（⑤a.），繼續(xù)用氯仿將其稀釋至濃度為0.1μg/mL 的儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液應(yīng)蓋好蓋，用鋁箔包裝好避光保存。
將儲(chǔ)備液放在冰箱中5℃以下保存。在這種情況下，儲(chǔ)備液可以穩(wěn)定2個(gè)月。2個(gè)月后，應(yīng)該對(duì)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性進(jìn)行核查。
c.黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)工作液? 從冰箱中取出儲(chǔ)備液（⑤b.）放置至室溫，然后移取一定量的儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋制備成工作液。工作液當(dāng)日使用當(dāng)天制備。
黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：用移液管準(zhǔn)確移取1.0mL 的儲(chǔ)備液到20mL 的錐形試管中，用恒流的氮?dú)鈱⒁后w慢慢吹干，然后用20.0mL 10％的乙腈將干基質(zhì)重新溶解，在30min 內(nèi)經(jīng)常振搖、充分混勻，配成濃度為0.005μg/mL 的黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)工作液。在用氮?dú)鈱?duì)儲(chǔ)備液吹干的過程中，一定要仔細(xì)操作，不能讓溫度降得太低，防止凝聚產(chǎn)生。
在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，注入 HPLC 的黃曲霉毒素 M1?量分別為0.05ng，0.1ng，0.2ng和0.4ng.根據(jù) HPLC 進(jìn)樣量，用工作液可以配制一系列適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋液用10％的乙腈。
4、儀器設(shè)備
使用實(shí)驗(yàn)室通用儀器設(shè)備，特殊情況說明如下。
①一次性注射器：10mL和50mL。
②真空系統(tǒng)。
③離心機(jī)：離心力4000g。
④移液管：1.0mL，2.0mL和50.0mL。
⑤玻璃燒杯：250mL。
⑥容量瓶：100mL。
⑦水浴：能在30℃±2℃，50℃±2℃，35～37℃之間溫度段使用。
⑧濾紙。
⑨有刻度的錐形玻璃試管：帶玻璃磨口的瓶頸和瓶塞，容量為5mL，10mL，20mL。
⑩高效液相色譜儀。
a.無(wú)脈沖泵：可以調(diào)節(jié)到恒體積流量為1mL/min。
b.進(jìn)樣系統(tǒng)：具有固定進(jìn)樣量，進(jìn)樣體積從50μL至500μL。
c.反相色譜柱：填充3μm 或者5μm 的十八烷基硅膠，加填充有反相材料的保護(hù)柱。
d.熒光檢測(cè)器：能夠產(chǎn)生365nm 的激發(fā)波長(zhǎng)、435nm 的發(fā)射波長(zhǎng)，在適當(dāng)?shù)纳V條件下能夠測(cè)定0.02ng 的黃曲霉毒素 M1（相當(dāng)于5倍噪音）。
e.記錄儀：帶打印機(jī)或標(biāo)繪器、或者電子積分儀、或者計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
①分光光度計(jì)：波長(zhǎng)范圍為200～400nm，帶1cm 的石英比色池。
天平：能夠稱量到0.1g，可讀至0.01g。
5、采樣
實(shí)驗(yàn)室收到的樣品應(yīng)該具有真正的代表性，在運(yùn)輸?shù)倪^程中沒有被損壞和變性。
6、分析步驟
（1）概述? 所有的操作分析均應(yīng)盡可能地在避光條件下進(jìn)行。
對(duì)于用奶粉沖制的牛奶，使其通過免疫親和柱，然后清洗、淋洗親和柱。親和柱的制造商規(guī)定的操作方法稍有差異，分析人員應(yīng)該嚴(yán)格地按照說明書進(jìn)行分析操作。通常的分析步驟包括：用水或者鹽水緩沖液將奶粉沖制成牛奶，離心分離后在一定壓力的作用下使牛奶樣品通過親和柱（可能需要預(yù)清洗）、用水清洗親和柱、用甲醇或乙腈將黃曲霉毒素M1從親和柱上洗脫下來(lái)。在操作過程中，特別要注意各種液體通過親和柱的流速。
（2）試樣制備
a.牛奶將牛奶樣品在水浴中加熱到35～37℃。用濾紙過濾（根據(jù)情況，也許需要用幾種不同規(guī)格的濾紙進(jìn)行過濾），或者在4000g下離心15min。至少收集50mL的牛奶試樣，按照④繼續(xù)進(jìn)行分析。
b.奶粉稱取10g 樣品（精確到0.1g）置于250mL 的燒杯。將50mL 已預(yù)熱到50℃的水每次少量地加入到奶粉中，用攪拌棒將其混合均勻。
如果奶粉不能完全地溶解，將燒杯在50℃的水浴中放置30min，仔細(xì)混勻。
將牛奶溶液冷卻至20℃后，用少量的水將其全部轉(zhuǎn)移到100mL 的容量瓶中，再用水稀釋至刻度。用濾紙過濾，或者在4000g 件下離心15min。至少收集50mL 的牛奶試樣，按照④繼續(xù)進(jìn)行分析。
（3）免疫親和柱的準(zhǔn)備?
將一次性的50mL 注射器筒與親和柱的頂部相連，再將親和柱與真空系統(tǒng)連接起來(lái)。?
（4）樣品的提取與純化?
用移液管移取50mL 的試樣到50mL 的注射器筒中，使它們以2～3mL/min 穩(wěn)定的流速通過親和柱，流速可以通過真空系統(tǒng)控制。
取走50mL 的注射器筒，并用干凈的10mL 注射器筒代替。然后用10mL 的水進(jìn)行清洗，水的流速應(yīng)該保持穩(wěn)定。清洗后，讓親和柱的下部分完全干燥。
使親和柱與真空系統(tǒng)脫離后，將4mL 乙腈加入到10mL 的注射器筒中將親和柱上的黃曲霉毒素 M1?淋洗下來(lái)。所有4mL 乙腈通過親和柱的時(shí)間至少需要60s，流速可以通過注射器的柱塞來(lái)控制。將洗脫液收集于錐形試管中，然后用恒流的氮?dú)庠?0℃下將洗脫液吹干至體積為50～500μL（注意：如果蒸發(fā)至完全干燥，則會(huì)造成黃曲霉毒素M1的損失），體積數(shù)為 V，用水將其稀釋10倍至最終體積數(shù)為 V（即500～5000μL）。（注意：如果注入HPLC 的含有黃曲霉毒素M1的樣品中乙腈含量超過10％，色譜峰變寬。如果水的含量超過90％，則對(duì)色譜峰的形狀沒有影響。）
（5）高效液相色譜分析儀
a.泵? 以恒定流速將洗脫液泵流通過 HPLC 柱。如果需要（根據(jù)所用色譜柱的型號(hào)），調(diào)整HPLC 洗脫液中乙腈/水的比例，以保證使黃曲霉毒素 M1?與其他成分的分離效果最佳。洗脫液的流速根據(jù)所用色譜柱的型號(hào)不同而有所差異。對(duì)于普通色譜柱（柱長(zhǎng)約25cm、柱內(nèi)徑約4.6mm）而言，流速在1mL/min 左右，效果最好；柱內(nèi)徑約4.6mm 時(shí)，流速在0.5mL/min左右，效果最好。
為了確定最佳的色譜條件，可以先將樣品提取液（最好不含有黃曲霉毒素 M1）注入HPLC，然后再注入提取液與黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合液。
b.色譜性能? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度和色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性需要經(jīng)常檢查，多次反復(fù)地注入固定量的黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)溶液， 直至獲得穩(wěn)定的峰面積和峰高。相鄰兩次峰面積和峰高的差異不得超過5％。
黃曲霉毒素 M1?的保留時(shí)間與溫度有關(guān)，所以對(duì)測(cè)定系統(tǒng)的漂移需要補(bǔ)償。過一段時(shí)間注入固定量的黃曲霉毒素 M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液，這些標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定結(jié)果可以根據(jù)漂移的情況進(jìn)行校正。
c.黃曲霉毒素 M1?的標(biāo)準(zhǔn)曲線? 根據(jù) HPLC 進(jìn)樣量，選擇適當(dāng)?shù)捏w積數(shù)為Ve，分別注入含有0.05ng，0.1ng，0.2ng和0.4ng的黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)溶液。繪制成峰面積或峰高對(duì)黃曲霉毒素 M1?質(zhì)量數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
d.樣品洗脫液的色譜分析及進(jìn)樣方案? 通過進(jìn)樣環(huán)將適量體積 Ve，洗脫液注入 HPLC。采用與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的色譜條件分離出洗脫液中的黃曲霉毒素M1。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品洗脫液均按照規(guī)定的方案進(jìn)樣。當(dāng)檢測(cè)一系列連續(xù)樣品時(shí)，建議每隔5個(gè)樣品，加測(cè)一個(gè)黃曲霉毒素M1?標(biāo)準(zhǔn)溶液。
根據(jù)樣品洗脫液色譜圖中黃曲霉毒素 M1?的峰高或峰面積值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出注入的樣品洗脫液中所含有的黃曲霉毒素 M1?質(zhì)量數(shù)（ng）。
如果樣品洗脫液的黃曲霉毒素 M1?的峰面積或峰高值高于標(biāo)準(zhǔn)溶解，用水定容稀釋樣品洗脫液后，重新進(jìn)樣分析。
7、測(cè)定結(jié)果的計(jì)算與表示
（1）牛奶
a.計(jì)算? 應(yīng)用下式計(jì)算被測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 M1?的含量m，單位為μg/L。
式中mA——根據(jù)樣品洗脫液的黃曲霉毒素M1的峰面積或峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的黃曲霉毒素M1的質(zhì)量數(shù)，ng；
Vi——注入樣品洗脫液的體積數(shù)，μL；
Vf——樣品洗脫液的最終體積數(shù)，μL；
V——通過親和柱被測(cè)樣品的體積數(shù)，mL
b.測(cè)定結(jié)果的表示? 測(cè)定結(jié)果單位以 μg/L 表示，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位。
（2）奶粉
a.計(jì)算? 應(yīng)用下式計(jì)算被測(cè)樣品中的黃曲霉毒素 M1?的含量 Ωp，單位為μg/L
式中，m 為50mL 樣液中所含有的奶粉質(zhì)量數(shù)，g；mA，Vf，Vi的含義與（7）①a.中所定義的一樣。
這個(gè)公式僅僅適用于被測(cè)溶液沒有稀釋的情況，如果需要稀釋，則應(yīng)該將稀釋倍數(shù)計(jì)算進(jìn)去。
b.測(cè)定結(jié)果的表示? 測(cè)定結(jié)果單位以 μg/kg 表示，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位。
