? ?必須對DNA和RNA分析的各步進行質量控制,以避免假陽性和假陰性,保證測定結果的準確性和重復性。由于核酸擴增測定的高敏感性,所以標本制備、逆轉錄、擴增本身和產物分析中的每一步都要求有質控措施。

　　(1)標本制備: 常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果,以判斷所提取的DNA是否發生降解。用常規的手工提取方法制備的DNA的平均長度一般為~100kb,用適合PCR的DNA提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30-40kb。明顯出現降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內)在經瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內切酶(如EcoRI)消化DNA,然后電泳分離,能夠對酶活性的抑制劑進行質控(在抑制劑存在的情況下,高分子量的片段不被酶切)。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計,質量好的DNA提取物,A260/A280比值應該在1.75~2.0之間；否則,殘留的蛋白或酚可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結論。

　　最快的對總RNA提取質量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電泳,這一點跟DNA分離相同。但如果對結果有疑問,就應該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下,三種主要的核糖體RNA(28S、18S和5S)在凝膠上出現的帶相對較窄。如發生RNA的降解,則出現大量低分子量帶或出現帶的消失。測定核糖體RNA帶的密度指數可作為對RNA制備的質量評價的實驗室內的標準；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標。另外,瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因,單獨的光度計比色方法也不能對RNA的完整性下結論。

　　對于血清(漿)中病毒的測定,則要評價標本出現溶血、脂血和黃膽情況下標本處理方法對擴增檢測的影響,避免由于標本處理方法的不當而出現假陰性結果。此外,還可采用已知濃度標本評價核酸提取方法的效果。

　　(2)逆轉錄和擴增:本部份包括陽性質控和陰性質控。

　　對逆轉錄和核酸擴增的質控既可使用內標質控方法也可采用外標質控方法。逆轉錄-擴增檢測的內標通常為在整個細胞周期中均勻表達的mRNA,如HLA、β肌動蛋白和組蛋白H3.3的mRNA或14S rRNA等。此外,也可在標本制備時將外來內標加入到樣本中共同提取、逆轉錄及擴增。當標本中存在逆轉錄抑制物,或核酸提取中發生RNA降解,或逆轉錄酶失活,內標即會表現為陰性結果。

　　對于DNA測定內標可使用對有機體存活所必須的靶基因,如維生素D血漿結合蛋白的基因。對于病原體的基因檢測,內標多采用人工制備的競爭性內標。內標可以監控每一擴增孔中假陰性的產生情況。

　　目前的商品試劑盒大部分沒采用內標方法質控。因此在測定血清/血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時,應使用已知的弱陽性血清/血漿作為質控樣本,與待測臨床標本等同處理提取核酸及擴增,以判斷逆轉錄及擴增檢測的效果。

　　使用這些外加弱陽性質控不但可檢測擴增反應液的質量,還可獲得有關PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。這些質控樣本在擴增檢測時必須使用與患者的標本相同的主反應混合液。

　　每一個PCR實驗中都必須設有外加陰性質控(污染監測質控),為判斷擴增過程中污染出現的階段,陰性質控可包括如下幾種,即在樣品制備的整個過程中所帶的空白管、僅有擴增反應液但不含擴增模板的反應管、陰性標本等。陰性標本可以評估PCR實驗的綜合質量。

　　在擴增靶RNA的RT-PCR實驗中,可做省略逆轉錄的污染質控,通過這種方法,可發現以前擴增的DNA片段所引起的污染。

　　(3)板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質控:在板上雜交和斑點雜交時,陽性和陰性質控應該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析,這可排除不同反應中因使用不同雜交條件所致的對結果的錯誤解釋。

　　(4)測定結果的評價與報告:采用實時熒光定量PCR檢測方法,在判斷結果時,應先對擴增的熒光信號作出定性判斷,然后再進行定量分析,避免一些非特異熒光信號對結果分析的干擾。

　　結果的報告必須簡單清楚。定性測定報告“陽性”或“陰性”即可。定量測定則必須報告量的多少,如結果高于測定方法線性范圍上限,則對樣本稀釋后再測,結果乘上稀釋倍數；如結果低于方法的測定范圍下限,則報告<多少即可,不能報告為“0”或“陰性”。