大腸桿菌感受態制備與質粒轉化
主要試劑
1、LB培養基(滅菌后使用)
胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g/L
酵母提取液(bacto-yeast extract) 5 g/L
NaCl 10g/L
用NaOH調pH至7.0。
2、LB固體平板
每升液體培養基中加入15g瓊脂粉,高壓滅菌后倒入滅過菌的培養皿中。
3、SOC培養基
20g/L Tryptone
5g/L Yeast extract
0.58g /L NaCl
0.186g /LKCl,滅菌后加入過濾除菌的2M葡萄糖(終濃度為20mM),1M MgCl2(終濃度為10mM)。
5.0.1M CaCl2(滅菌后使用)
6. 0.1M CaCl2+10%甘油
7. 保存于-80℃冰箱的DH5α 或DH10B甘油菌
主要儀器
恒溫搖床
冷凍離心機
實驗步驟
一 、 熱擊感受態細胞的制備及熱擊轉化
1、細菌培養
1) 從平板上挑取大腸桿菌(DH5α或DH10B)單菌落,放到LB培養基中。(液體培養基的體積為溶液容積的1/3-1/4為宜)。
2) 在37℃,220 rpm培養10h左右。
3) 中吸取2 mL培養液到裝有200 mL LB培養基的三角瓶中,37℃,220 rpm培養2-3hrs,使其OD600達0.5-0.6。
2、細菌收集
將培養液倒入預冷的50 mL離心管中,置于冰上。3000 rpm離心5-10min。
3、感受態制備
1) 倒棄上清后,加入適量(20mL左右)的預冷的0.1M CaCl2,懸浮菌體,冰上放置30 min。
2) 4000 rpm離心5-10min,倒棄上清后再加入適量(20mL左右)的預冷的0.1M CaCl2,懸浮菌體。
3) 4000 rpm離心5-10 min,加入少量0.1M CaCl2+10%甘油懸浮菌體。
4、感受態保存
將上述感受態細胞分裝于0.5 mL Eppendorf管(100mL/管)中,置于-70℃貯存備用。
5、感受態融化
從冰箱中取出制備好的感受態細胞,放在冰上,使其融化。并將準備好的質粒也放在冰上。
6、轉化
在一個預冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受態細胞和1μL質粒,混勻,置于冰上30min。42℃,90S后立即移至冰上。
7、 轉化物液體培養
將轉化后的混合物轉至含有1mL SOC培養基的離心管中,37℃、200 rpm培養1h。
8、涂板與培養
取100 μL培養液,均勻涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培養箱過夜培養。培養好的平板放入4℃冰箱。
二、 電擊感受態細胞的制備及轉化
1、細菌培養
1)從平板上挑取大腸桿菌(DH5α或DH10B)單菌落,放到LB培養基中。(液體培養基的體積為溶液容積的1/3-1/4為宜)。
2)37℃,220 rpm培養10 h左右。
3)從中吸取2 mL培養液到裝有200 mL LB培養基的三角瓶中,37℃,220 rpm培養2-3 h,使其OD600達0.8-1.0。
2、細菌收集
將培養液倒入預冷的50mL離心管中,置于冰上。3000 rpm離心5-10min。
3、甘油處理細胞
棄上清(倒干凈)后,加入適量(20 mL左右)的預冷的10%甘油,懸浮菌體。
4、細胞保存
3000rpm離心5-10 min,倒棄上清后再加入少量10%甘油懸浮菌體。將上述菌液分裝于0.5 mL Eppendorf管中,置于-70℃貯存備用。
5、感受態融化
從冰箱中取出制備好的感受態細胞,放在冰上,使其融化。并將準備好的質粒也放在冰上。
6、轉化
在一個預冷的0.5mL Eppendorf管中加入100 μL感受態細胞和1μL質粒,混勻,置于冰上。連接好電擊儀,電擊杯預冷。將待擊混合液加到電擊杯兩電極之間(不能有氣泡),380V電擊。
7、轉化物液體培養
將轉化后的混合物轉至含有1mL SOC培養基的離心管中,37℃、200rpm培養1h。
8、 涂板與培養
取5 μL培養液,均勻涂布于LB 平板上。
LB 平板置于37℃培養箱過夜培養。培養好的平板放入4℃冰箱。
實驗結果
在含Amp的LB平板上將看到若干白色的菌落,即是陽性克隆。
如果未出現陽性克隆,則可能是感受態細胞活性太低,或轉化的效率太低。
注意事項
1、在所有的實驗中要注意嚴格無菌操作。
2、所用耗材滅菌后使用。
3、感受態細胞不能放在常溫下放置;必須在超低溫下保存。
4、轉化過程要嚴格控制時間和溫度
相關知識
轉化(transformation):使受體細胞從周圍介質中吸收外來DNA分子,從而獲得新的遺傳物質的過程就是轉化。
感受態細胞(competent cell):用于轉化的細菌稱為感受態細胞,它是指細菌細胞處于一種最易吸收外來DNA的狀態。
載體(vector):用于攜帶重組DNA,并能夠使外源DNA能復制與表達的運載工具。
世界上現在使用較多的質粒載體主要有pBR322系列、pUC系列(如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119)、M13系列、pSP系列、pGEM系列等。
pGEM-T
easy載體是將pGEM-Zf(+)用EcoRV在其兩端加上“T”,這有利于PCR產物的克隆,因為PCR反應結束時,Taq酶會在PCR產物的末端加上一個“A”。pGEM-T
easy載體全長3015bp,含有多個限制性內切酶位點。限制性內切酶位點的兩側有T7、SP6
RNA聚合酶啟動子位點,并且含有M13正、反向序列(如圖)。pGEM-T easy載體作為一種商品化的載體存在幾個優點:
(1) 與PCR產物連接效率較高。
(2) T7、SP6、M13位點有利于插入片段序列的測定。
(3) M13序列有利于插入序列的PCR擴增。
(4) 其兩端都存在EcoRI酶切位點,使得插入序列酶切極為方便。
(5)含有LacZ基因,含重組質粒的菌落用藍白斑鑒定。