質(zhì)粒酶切電泳注意事項
僅條帶看不清，連marker都看不清。牢記，否則你會認(rèn)為自己的實驗失敗。
我還認(rèn)為是EB加少了。
2 1％agrose 凝膠的配制， 50*TAE BUFFER.稀釋成1×。0.3g 加30ml,微波爐中 40s, 不能太長，否則液體會蒸發(fā)， 量會減少。 等待融化的膠冷卻之后，再加1ul 的EB.撲膠。半個小時后，待膠凝固之后， 將凝膠加托放到電泳液中。電泳30分鐘。
3 加樣時loading buffer 10*,要稀釋成1×。Marker 要用10ul. 一定要注意加樣順序。
酶切反應(yīng)注意事項：
1質(zhì)粒的量一定要過量。 50ul洗脫液的小抽質(zhì)粒要用16ul. E:2ul. Buffer:10*2ul. 反應(yīng)體積20ul.正常情況下37度反應(yīng)2到3小時足夠。否則， 質(zhì)粒量少，你會看不到條帶。
質(zhì)粒抽提注意事項：
1 質(zhì)粒抽提前要準(zhǔn)備好試劑，要看每一步用到的試劑量是否夠，p1 ＆洗脫液放到4度。
2注意每一步都要編上序號，按序號操作。最終保證質(zhì)粒＆菌液對應(yīng)。
挑選單克隆菌落時注意事項：
1準(zhǔn)備好無抗生素LB液體培養(yǎng)基，抗生素 ，7ml (非4ml)管。
2選單克隆時可以選取邊緣顆粒較大的菌落。
3菌落通常很密集很小，很難挑選單克隆。
轉(zhuǎn)化注意事項：
1超凈臺一定要事先照紫外。
2質(zhì)粒的選取一定要無菌。
3準(zhǔn)備好：質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化試劑盒
質(zhì)粒5ul(0.3ug/ul)有些多，以后用1ul
試劑A:10ul,無菌水40ul,大腸桿菌50ul.冰上20min,室溫10min. 加無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37 度，200轉(zhuǎn)，搖床上搖45min。取50ul鋪皿。鋪的效果不好。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后鋪皿與連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后鋪皿的效果相差很大。 連接產(chǎn)物鋪皿后菌落一般都很大，而質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后鋪皿菌落一般都很小，而且很密集。
