土壤總DNA的幾種提取方法
SDS?高鹽法（方案1）? ?
具體步驟:?
稱取1?g?土壤,放入研缽中,倒入適量的液氮,立即研磨;再倒入適量的液氮,研磨,重復3?次,使土壤顆粒研成粉末;?
將13.5?ml?提取緩沖液（0.1?mol/L磷酸鹽[pH?=?8.0?]?,0.1?mol/L?EDTA?[pH?8.0?]?,0.1?mol/L?Tris-HCl?[pH?8.0?]?,1.5?mol/L?NaCl?,1.0?%?CTAB）?和50μl蛋白酶K（10?g/L?）?與5?g?土壤置于50?ml?的離心管中,放入37?℃恒溫搖床上,225?r·min?-?1振蕩30?min?;?
加入1.5?ml20?%?SDS?,輕輕混勻,65?℃水浴加熱2?h?,每隔15～30?min?輕輕搖勻1?次;5?000?r·min?-?1離心10?min?,將上清液轉入新的50?ml?離心管中;取4.5?ml?提取緩沖液加入原離心管,搖勻泥漿,加入0.5?ml?20?%?SDS?,65?℃水浴15?min?,用上述同樣的離心速度離心10?min?,將上清液與原上清液合并;再重復此步驟1?次;?
用與上清液等量的三氯甲烷于離心管中混勻,5000?r·min?-?1離心20?min?;收集上清液,并加入0.6?倍體積的異丙醇,室溫靜置1?h?;25?℃下12?000?r·min?-?1離心20?min?,倒出上清液,干燥后加入500μl?去離子水,溶解粘附于離心管壁的DNA?及其雜質,并收集于1.5?ml?的微型離心管中.?
變性劑加SDS?高鹽法（方案2）?
具體步驟：?
取1?g?土樣和等量的滅菌石英砂在研缽中混合,加入1?ml?變性劑（4?mol/L異硫青酸胍,10mmol/L?Tris-HCl?[pH?7.0?]?,1?mmol/L?EDTA[pH?8.0?]?,0.5?%?2-巰基乙醇）?;液氮冰凍,研磨至溶解,重復3?次;?
轉入50?ml?離心管中,加入9?ml?提取緩沖液（0.1?mol/L磷酸鈉[pH?7.0?]?,?Tris-HCl?[?pH?7.0?]?,?0.1?mol?/L?EDTA?[?pH8.0?]?,1.5?mol/L?NaCl?,1?%CTAB?,2?%SDS）?;65?℃水浴1?h?,每10?min?輕輕混勻1?次;5?000?r·min?-?1?離心10?min?,取上清;?
在原管中加入5?ml?提取緩沖液,混合后,65?℃水浴10min?,離心,取上清,合入上述上清液;重復一次;加入等體積的氯仿混合,5?000?r·min?-?1離心20?min?,取上清;加入0.6?倍體積的異丙醇,室溫沉淀1?h?;20～25?℃,12?000?r·min?-?1離心20?min?,TE?溶解沉淀.?
SDS-酚氯仿抽提法（方案3）?
稱取1g土壤樣品，加入1ml?0.1mol/l?PH8.0?磷酸緩沖液，玻璃珠振蕩1min。溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml,室溫振蕩15min,放置冰箱30min，加125ul?20%SDS振蕩處理15min，離心，分裝EP管，加酚（1：1體積），抽提1次，氯仿-異戊醇（1：1體積），抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置1h,離心，70%乙醇清洗，200Ul?TE?溶解。?
凍融溶菌酶SDS裂解法（方案4）?
取1g土壤樣品，加如0.5ml滅菌的抽提緩沖液（100?mmol/L?Tris-HCl?,?100?mmol/L?EDTA,?200?mmol/L?NaCl,?1.0%?PVP,?2.0%CTAB?,?PH8.0）,?加玻璃珠旋渦5~10?min，在液氮中冷卻1?min后迅速在沸水中煮2?min，如此重復3次，13?000r/min離心10?min。上清夜快速置于冰上備用，沉淀用于進一步裂解。將上述沉淀懸浮于0.2ml提取緩沖液中，旋渦10min，加入溶菌酶（100ml/l）50ul,輕輕混勻后，37C溫浴30min，再加入250ul?SDS?緩沖液（100?mmol/l?Tris-HCl,?200?mmol/l?NaCl,2.0%?SDS,?PH8.0）,上下顛倒10min，13000?r/min離心10min,收集上清夜。?
二、DNA純化?
葡聚糖-200凝膠G離心層析純化?
取2ml滅過菌的一次性塑料注射器，用注射器推桿將滅過菌的玻璃棉推到注射器筒底部，使其厚度約為0.5cm，然后向注射器筒中加入TE緩沖液浸透的葡聚糖凝膠G-200，制成簡式離心層析柱，再置于10ml的離心管中，于高速冷凍離心機上以3000r/min離心20min，去除葡聚糖凝膠G-200中的TE緩沖液，將離心層析柱再置于另一10ml的離心管中，在離心層析柱頂部加入50ul粗土壤DNA，以10?min為周期于3000r/min離心，分別收集層析液。層析液濃縮至50ul?
三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳?
證明存在DNA。?
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四、DNA?的純度和定量檢測?
用紫外分光光度計測量純化后的DNA?溶液在波長為230?nm、260?nm、280?nm?下的OD?值，分別算出A260/A230及A260/A280值。來估計DNA的純度。?
五、 純化后土壤DNA?的PCR擴增?
PCR?反應體系為50μL?,模板為1μL?。PCR反應引物（放線菌通用引物）:?
反應條件:?94?℃?3?min?預變性;?94?℃?1?min?,?56?℃1?min?,72?℃1?min?,30?個循環;72?℃補平5?min。PCR?產物用2?%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。?
六、檢測擴增結果?
凝膠電泳，用溴乙錠染色，在紫外光下檢查結果。
