葉綠素a和b含量的測定（分光光度法）
原理
如果混合液中的兩個組分，它們的光譜吸收峰雖有明顯的差異，但吸收曲線彼此又有些重疊，在這種情況下要分別測定兩個組分，可根據Lambert—Beer定律，通過代數方法，計算一種組分由于另一種組分存在時對吸光度的影響，最后分別得到兩種組分的含量。
如圖9葉綠素a和b的吸收光譜曲線，葉綠素a的最大吸收峰在663nm，葉綠素b在645nm，吸收曲線彼此又有重疊。
根據Lambert—Beer定律，最大吸收光譜峰不同的兩個組分的混合液，它們的濃度C與吸光度A之間有如下的關系（參閱實驗86）：
A1 =Ca ·ka1 Cb ·kb1 (1)
A2 =Ca ·ka2 Cb ·kb2 (2)
式中：Ca 為組分a的濃度，g/L。
Cb 為組分b的濃度，g/L。
A1 為在波長λ1 （即組分a的最大吸收峰波長）時，混合液的吸光度A值。
A2 為在波長λ2 （即組分b的最大吸收峰波長）時，混合液的吸光度A值。
ka1 為組分a的比吸收系數，即組分a當濃度為1g/L時，于波長
λ1 時的吸光度A值。
kb2 為組分b的比吸收系數，即組分b當濃度為1g/L時，于波長λ2 時的吸光度A值。
ka2 為組分a（濃度為1g/L）在波長λ2 時的吸光度A值。
kb1 為組分b（濃度為1g/L）在波長λ1 時的吸光度A值。
從文獻中可以查得葉綠素a和b的80%丙酮溶液，當濃度為1g/L時，比吸收系數k值如下：
將表中數值代入上式(1)、(2)，則得：
A663 =82.04×Ca 9.27×Cb
A645 =16.75×Ca 45.60×Cb
經過整理之后，即得到下式：
Ca =0.012 7 A663 —0.002 69 A645
Cb =0.022 9 A645 —0.004 68 A663
如果把Ca ，Cb 的濃度單位從原來的g/L改為mg/L，則上式可改寫為下列形式：
Ca =12.7A663 —2.69A645 (3)
Cb =22.9A645 —4.68A663 (4)
Ct =Ca Cb =8.02A663 20.21A645 (5)
(5)式中Ct 為總葉綠素濃度，單位為mg/L。
利用上面(3)、(4)、(5)式，即可計算出葉綠素a和b及總葉綠素的濃度。
注：一般大學教學實驗室所用的分光光度計多為721型，屬低級類型，其單色光的半波寬值要比中級類型的751型大得多，而葉綠素a和b吸收峰的波長相差僅18nm（663─645nm），難以達到精確測定。此外有時還由于儀器本身的標稱波長與實際波長不符，測定的正確性就更差了。根據公式計算往往會得到葉綠素a∶b值小于1，這就不很奇怪了。除向學生說明其中原因外，還可以在實驗前對儀器的波長進行校正，使標稱波長與實際波長一致。校正可用純的葉綠素a和b進行，分別在波長650─670nm和630梍650nm之間，每隔1─2nm測定葉綠素a或b的吸光度A，以確定葉綠素a和b的吸收峰的波長。如果測得的峰值與文獻上的峰值663nm和645nm不同，可按照儀器說明書步驟進行校正，或者更方便的方法可以打開儀器蓋子，松動波長刻度盤緊固螺絲，調節刻度盤使波長至正確值，而后旋緊螺絲復原儀器。
為校正儀器波長所需的葉綠素a和b的用量是很少的，用紙層析法很快就能分離制得。取植物葉子約1g，用乙醚提取葉綠體色素，再用毛細管將色素溶液畫在3mm厚濾紙上使成一直線，為使分離效果好，一般重復點樣一次即可。然后于密閉容器中進行上行層析，溶劑為含0.5%丙醇的石油醚。層析結束，用剪刀小心地剪下藍綠色的葉綠素a和黃綠色的葉綠素b，注意剪時盡量避開有可能遭污染的色區。最后分別浸于80%丙酮中，洗下葉綠素a和b。
