HPLC簡介
目錄
1 高效液相色譜法的定義
2 對儀器的一般要求和色譜條件
2.1 色譜柱
2.2 檢測器
2.3 流動相
3 系統適用性試驗
3.1 色譜柱的理論板數（n）
3.2 分離度（R）
3.3 重復性
3.4 拖尾因子（T）
4 測定法
4.1 內標法
4.2 外標法
4.3 加校正因子的主成分自身對照法
4.4 不加校正因子的主成分自身對照法
4.5 面積歸一化法
5 參考資料
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1 HPLC的定義
HPLC是指具有高分離效能的柱液相色譜法[1]。
HPLC系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法[2]。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各組分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。
2 對儀器的一般要求和色譜條件
HPLC所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規定。
2.1 色譜柱
反相色譜系統使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。
使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果為準。
以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。
流動相的pH值應控制在2～8之間。當pH值大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機一無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機－無機雜化填充劑等。
2.2 檢測器
最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。
紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與供試品的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外－可見分光光度法（2010年版藥典二部附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。
2.3 流動相
反相色譜系統的流動相首選甲醇－水系統（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈－水系統），如經試用不適合時，再選用其他溶劑系統。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。
各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并達到系統適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對于自身的改變量不超過±30%且相對于總量的改變量不超過±10%為限，如30%相對改變量的數值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%為限。
對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。
3 系統適用性試驗
HPLC的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數。其中，分離度和重復性尤為重要。[2]
按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。
3.1 色譜柱的理論板數（n）
用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數。
在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按n16（tR/W）2或n5.54（tR/Wh/2）2計算色譜柱的理論板數。
3.2 分離度（R）
用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統效能的關鍵指標?？梢酝ㄟ^測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統進行評價與控制。
無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為：
式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬（如圖）。
當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。
3.3 重復性
用于評價連續進樣中，色譜系統響應值的重復性能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%；采用內標法時，通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大于2.0%。
3.4 拖尾因子（T）
用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式為：
式中W0.05h為5%峰高處的峰寬；
d1為峰頂點至峰前沿之間的距離（如圖）。
除另有規定外，峰高法定量時T應在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子作出規定。
4 測定法
4.1 內標法
按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
式中?AS為內標物質的峰面積或峰高；
AR為對照品的峰面積或峰高；
cS為內標物質的濃度；
cR為對照品的濃度。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：
式中AX為供試品的峰面積或峰高；
cX為供試品的濃度；
A'X為內標物質的峰面積或峰高；
c'S為內標物質的濃度；
f為校正因子。
采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。
4.2 外標法
按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：
式中各符號意義同上。
由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中成分或雜質含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。
4.3 加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。
測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的10%～25%或其峰面積能準確積分[通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%;含量在0.5%～2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%;含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%]。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。
4.4 不加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調節檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間，除另有規定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。
若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。
4.5 面積歸一化法
按各品種項下的規定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。
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