pcr電泳條帶圖的解讀
前 言
基因的變異類型有多種，對應的分子檢測方法亦有多種，當前資本市場驅動著分子檢測市場，并極力追捧NGS技術，因為其通量高，靈敏度高且性價比高。小編承認NGS是分子檢測的必然發展趨勢，但是短時間內，NGS并不會取代其他分子檢測方法，因為針對不同的需求，都有對應的理想檢測方法，每個檢測平臺都有著自己的優勢，比如：
操作簡單：PCR，ARMS-PCR，HRM等
時間快速：ARMS-PCR，HRM等
成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等
準確：Sanger等
通量高：NGS等
靈活性：Pyrosequencing等
結果分析簡單：ARMS-PCR等
自動化：核酸提取等
......
小編一直認為：沒有最好的技術，只有最合適的技術！最好的，不一定是最合適的；最合適的，才是真正最好的。
今天，我們聊一聊PCR電泳技術。首先，我們先了解什么是PCR技術？
PCR：聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）,一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。
1983年美國Kary Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生，1993年Kary Mullis因發明PCR方法獲得諾貝爾化學獎。
Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry (1993)
PCR的原理：PCR的基本過程類似于DNA的天然復制，特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構成：
1，模板DNA變性：模板或經PCR擴增形成的DNA經加熱至94℃左右一定時間后，雙鏈之間氫鍵斷裂，雙股螺旋解鏈，變成兩條單鏈，以便它與引物結合，為下一輪反應做準備。
2，模板DNA與引物的退火（復性）：DNA加熱變性成單鏈后，當溫度降至一定程度（55℃左右）時，引物即與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
3，引物的延伸（72℃）：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引物以dNTP為原料，按A-T、C-G堿基配對與半保留復制原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補的鏈。
重復上述 變性-退火-延伸 的循環過程，每一循環獲得的“半保留復制鏈”都可成為下次循環的模板。通常每完成一個循環需時為2~4min，2~3h就能將靶核酸擴增放大上億倍（30個循環時，靶產物數量約為10億）。（注：PCR的第1和第2個循環，并沒有短的目的片段，只是在第3個循環后才有，并且有部分雙鏈的長片段將始終伴隨整個擴增過程）
PCR的擴增原理
PCR電泳法應用實例介紹
比如現在有一名高血壓患者，我現在要做高血壓個性化用藥基因檢測（點擊查看），擬選擇卡托普利進行降壓，那么需要對ACE I/D突變進行檢測。經過引物設計（點擊查看），最終的野生型目的片段約在200bp左右，由于突變型的目的片段比野生型的多了287bp的插入，那么突變型的片段約在500bp左右。
ACE I/D 16號內含子中存在的287bp插入
DNA經過PCR的擴增后，我們對擴增的產物進行電泳檢測，DNA凝膠電泳所需的標準瓊脂糖濃度一般為1.0%。濃度越高，小條帶的分辨率越高；反之，瓊脂糖濃度越低，大分子量條帶的分辨率和分離程度越高。
在電場中，中性pH值緩沖液（TAE/TBE）下DNA都帶凈負電荷并向凝膠裝置正極(+)方向移動（下圖中，上為“-極”至下為“+極”），DNA分子越大則所受阻力越大，也越難在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢，比如500bp的DNA分子比200bp的DNA分子遷移就慢。
此外，電泳時需要將DNA與熒光染料混勻，結合染料后，DNA會在紫外燈下發出熒光，這樣才會出現下圖中的亮色條帶，常用的染料有EB（溴化乙啶）、gel red、sybrgreen1等（有錢建議不要用EB，因為有毒）。
在電泳結束后進行結果解讀，我們無法直接判斷DNA的長度，所以需要在電泳過程將DNA產物與DNA標準品（DNA Marker）一起跑電泳，DNA Marker里面含有若干種長度已知的DNA（下圖中出現6條亮帶的就是DNA Marker），通過與之比較可以粗略判斷DNA樣品的長度。同時DNA Marker中的DNA片段濃度已知，通過與DNA Marker的亮度進行比較也能初步判斷DNA樣品的濃度。
結果解讀：通過與DNA Marker比較，如果是野生型，那么就是左邊這個圖，可發現DNA片段長度大小約為200bp，如果是突變型，那么就是右邊這個圖，突變有純合突變和雜合突變兩種，中間一條500bp的條帶即為純合突變，最右邊的200bp及500bp兩條條帶即為雜合突變，通過PCR及簡單的電泳法便可準確的進行ACE I/D的檢測。
ACE I/D電泳結果
整個實驗主要操作步驟
PCR電泳技術點評
優點：
1，操作簡單；
2，時間較快；
3，實驗設備比較普及；
4，成本低。
缺點：
1，通量低；
2，檢測局限性；
3，部分結果不容易判斷。
此方法適宜于硬性條件不好的實驗室進行低通量的分子檢測。
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技術原理
