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多重PCR核酸檢測

2021.6.29

2020年3月11日，世衛組織總干事譚德賽在日內瓦召開的新聞發布會上宣布，新冠肺炎（COVID-19）疫情已經構成全球性大流行（pandemic）。截止到目前，中國的疫情在國內聯防聯控機制下已基本得到控制，而國外的情況卻不容樂觀。

新冠肺炎疫情爆發于呼吸道疾病高發的季節，有各類呼吸道病原體單一感染或合并感染的情況出現。因此，精準的鑒別診斷是針對病情開展有效治療的前提。國家衛健委發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中也指出：對疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測和多重PCR核酸檢測等方法，對常見呼吸道病原體進行檢測。

什么是多重PCR核酸檢測？

一般的PCR反應僅應用一對引物，通過PCR擴增對單個基因序列進行復制，主要用于單一靶標的檢測。多重PCR（Multiplex PCR），是在同一PCR反應體系里加上兩對或以上的引物，同時進行多個基因的擴增檢測。

多重PCR反應最常見的類型是雙重反應。在一定情況下，為了能夠同時檢測多個靶標基因，多于雙重的反應也是可以實現的，但是需要更多的設計與驗證工作來保證多重反應體系的穩定性。

多重PCR核酸檢測主要用于樣本中單個病原體的多個靶標、多種病原體或多個突變位點的聯合檢測，針對一個樣本單次測試可以給出更多檢測指標，為臨床提供更多檢測信息。

多重PCR技術原理

多重PCR技術具備單個反應體系檢測多種靶標的能力，但是如果需要鑒別反應體系中的不同靶標基因，則需要針對不同的靶標，設計特異性的探針并標記熒光基團，不同的靶標標記不同的熒光基團。為了避免熒光基團之間的相互干擾，應合理選擇不同光譜范圍的熒光基團。熒光基團應與使用的熒光定量PCR儀器具有適配性，每個熒光通道進行單個靶標基因的讀取。考慮到PCR儀熒光串擾問題以及反應體系中引物探針互相的干擾作用，目前市面上的PCR儀最多支持4個通道檢測，即單管鑒別4個靶標基因。

如何突破多重PCR技術瓶頸，破解單通道只能鑒別單個靶標基因的難題？一種基于熒光定量PCR平臺的新型多重熒光PCR技術被開發并獲得了國家知識產權局頒發的發明ZL證書。該方法將傳統的實時熒光定量PCR法與PCR熔解曲線法相結合，在同一個熒光通道，針對一個靶標基因設計特異性引物以及特異性熒光探針，另一個靶標基因采用ZL特殊的寡聚核苷酸修飾技術。從而實現在一個熒光通道中進行多個靶點的同時檢測，極大地增加了常規熒光PCR儀器的檢測通量，為臨床的多病原體檢測提供更為有力的工具。

多重PCR技術的應用

一個反應中檢測單個病原體多基因

多重PCR技術更多的時候用于單個病原體的檢測，其中包括“內標+靶標基因”與“內標+多個靶標基因”的組合方法。試劑盒中添加內標，可使結果更加準確可靠，避免因試劑操作過程出現的假陰性。圣湘生物是“內標法”的國內率先應用者。

多家企業針對本次疫情開發的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒就屬于“內標+多個靶標基因”的多重PCR技術。國家衛健委印發的最新版《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》，推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區域的引物和探針設計核酸檢測試劑盒。從《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》中可以看出，大部分廠家為雙靶標檢測試劑，僅有一家為單靶標試劑。同時針對兩個靶標的檢測試劑，可以最大程度保證檢測的特異性并避免漏檢的發生。

一個反應中檢測多個病原體

本次新冠疫情防控工作中，多次強調了呼吸道病原體鑒別檢測的重要性。近期，圣湘生物利用多重PCR技術開發的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒、乙型流感病毒多重核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)已獲得歐盟認證機構頒發的CE認證證書。另外，還有六項呼吸道病原體核酸檢測試劑盒以及七項呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒，進行常見呼吸道感染相關病原體的檢測與鑒別。