DAD檢測器判別液相色譜純度的原理及其局限性
高效液相色譜法對主成分及雜質的定性定量分析的前提是色譜峰為單一流出峰，如有共流出物的存在，會直接導致分析方法驗證的失敗，故一般在分析方法開發初期即需對目標色譜峰是否為單一峰進行檢查。采用DAD檢測器可以對各成分的光譜純度進行分析，結合其他分析手段可確認主成分色譜峰的純度。然而在用DAD檢測器進行峰純度檢查時，往往出現明顯存在雜質峰，峰純度檢查卻顯示通過或已確認為單一峰，可峰純度檢查卻無法通過的現象。此時，須對可能影響DAD檢測器純度檢查的因素進行排查，以便對結果做出正確的判斷。DAD檢測器進行純度檢查的基礎是各成分間紫外光譜存在差異，但也會有雜質與主成分的紫外光譜無明顯差異或完全一致的情況，這種情況下用DAD進行色譜峰純度檢查就無能為力了。
一 工作原理
關于色譜峰純度的原理，工作站依據光譜匹配度來衡量峰純度，光譜可以用來表征化合物分子結構特征，在進行峰純度檢測時，工作站會將被檢測峰上采集的所有光譜做歸一化處理，然后比較光譜的匹配性。如果一個色譜峰中只含有一種組分(峰純度很好)，峰上各個時間點采集到的光譜的外形幾乎是一致的，做歸一化處理后所有的光譜幾乎一樣的，如果所有的光譜一模一樣，則匹配因子將達到1000(100%匹配)；如果一個色譜峰含有多種組分，只要組分間的光譜有差異，當將峰上每個采集時刻的光譜做歸一化處理之后匹配度自然很差。峰純度的閾值相當于一個衡量標準，能影響到峰純度檢測直接給出的結果，我們可以選擇由工作站來計算閾值(工作站根據被檢測峰的信噪比計算，因此每個峰給出的閾值會略有不同)，也可以自行設定固定閾值，推薦值是990(相當于99%相似)。
二 峰純度測定步驟
以安捷倫高效液相色譜儀為例，僅供大家參考
a.設置純度檢測閾值
點擊Spectra(光譜)菜單下的Spectra Options(光譜選項)，在光譜選項窗口點擊Purity(純度)，或選擇Calculate Threshold(計算閾值)，或選擇Fixed Threshold(固定閾值)，建議選擇計算閾值，如果純度檢測結果顯示的計算閾值過小再考慮設置固定閾值，推薦的固定閾值是990。
b.調用數據文件
注意，如果要使用峰純度檢測功能，采集數據之前一定要在DAD參數設置窗口選擇保存全部光譜(英文工作站選擇All)。
c.將光標切換到峰純度檢測狀態
點擊Spectra(光譜)菜單下的Select Peak Purity(選擇峰純度)，光標即變為峰純度檢測狀態，點擊要檢測的色譜峰即可得到結果。
d.峰純度的結果
在右下方的窗口中可以看到色譜峰、閾值曲線和相似度曲線，相似度曲線對應的點低于閾值曲線即表明沒有超出閾值
可以點擊峰純度信息快捷鍵(如下圖)，查看當前的Purity factor(峰純度因子)和Threshold(閾值)。
三 利用光譜進行純度檢測的局限性
高效液相色譜法定性定量的前提是色譜峰由單一組分構成，因此色譜峰的純度，即一個色譜峰究竟是由一種組分構成，還是包含了兩種或者兩種以上的成分成為人們首先關心的問題。二極管陣列檢測器（DAD）的開發是過去20年內高效液相色譜技術的重要進步，它用于研究及日常分析可提供最佳波長的確定、峰純度判別以及色譜峰的定性功能。DAD檢測器可以得到任何一時刻各個波長下的吸光度值，即可以得到樣品在各個時刻的吸收光譜圖。
使用這些方法判別峰純度時都要求待測組分色譜峰中共洗脫雜質的紫外光譜明顯不用于主組分的紫外光譜。光譜間的差異越大，對于共洗脫雜質的檢測限就越低。然而，有機物的紫外光譜一般均顯示曲線變化不明顯的寬帶，缺乏能夠說明細微差別的精細結構，尤其是對于那些生色團相同，而結構上的差異部分由于生色團不同的化合物間的結構差異不能夠給予足夠的描述。實際上許多情況下，例如同分異構體的雜質和主組分的降解或代謝產物與主組分在結構上是非常相似的，這時利用組分的紫外光譜信息判別色譜峰純度就會遇到不能檢測到分析物的共洗脫雜質的情況，甚至有時候會給出完全錯誤的峰純度結果，從而給下一步的定性定量分析帶來很大的誤差。
其局限性主要總結如下：
1、當我們用普通的C18柱(而非手性柱)分析手性樣品時，純度檢測就無能為力了，手性組分中不同消旋體之間的光譜是一致的；
2、 如果混合物中組分間的光譜類似，而各組分在色譜柱上的擴散程度也幾乎一致(完全沒有分開)，各個時間點采集到的混合光譜幾乎是一致的，也會得到很高的純度匹配因子；
3、另外當被檢測峰的濃度很高時，會導致尤其是峰頂點處的光譜由于濃度高而變形，即便是純的組分也很可能得到很低的純度因子；
4、如果采集的光譜較少，則純度檢測的結果基本上是不可靠的，假設峰上只采集了一張光譜，即便是混合物，純度因子卻能達到1000。
總結看來，峰純度功能可以給出否定的答案(色譜峰是混合物)，很難給出肯定的答案(色譜峰是純的)，只能說可能是純的，此時峰純度信息僅作為參考信息。
四 結語
DAD或PDA配合數據處理系統，給出的色譜峰純度結果，理論上講，只是參考值。如對于對映異構體來說，同一對對映異構體之間互為手性雜質，但他們卻具有完全一致的光譜形狀和吸光特點，而且在非手性分離條件下，出峰位置完全一致，此時檢測器的色譜峰純度檢測功能就不能檢測到該手性雜質。甚至在手性環境下，對映異構體之間已經實現了部分分離的時候，理論上講，色譜峰純度檢測功能依然無法將其分別判定為雜質。
對于完全沒有分開的兩個色譜峰進行色譜峰純度檢測的時候，由于兩個色譜峰完全重疊，任意一個時刻的光譜圖均是兩個洗脫組分的吸收光譜圖疊加之后的結果，在這種情況下，色譜峰純度檢測功能也無法判斷出該色譜峰是不純的。
因此，對于可能存在于主組分結構相似的雜質的樣品體現的液相色譜分析方法，峰純度的可靠評價最好是通過收集色譜峰流出液，然后更換不同的色譜體系或者是由對微小結構差異靈敏的質譜等手段來驗證。
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技術原理
