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單細胞測序的臨床應用

2024.7.08

近期精準醫學的進展集中在發展基于基因組學的診斷和治療。這些方法通常包括從患者的組織樣本中生成DNA或RNA序列信息，并分析它以確定可用于診斷、預后或通知臨床管理的特定特征。‘bulk’一詞指的是從大量細胞中集體生成基因組數據的方法，或者在無細胞DNA的情況下，來自許多細胞的基因組材料。因此，這些基因組信息代表了大量細胞的平均信號。盡管這些方法已經導致了重要的發現和臨床實踐的變化，但批量分析不能輕易揭示細胞之間的基因組差異。這個限制是至關重要的，因為大多數系統在細胞之間都有顯著的基因組異質性，這是臨床特征的廣泛基礎。這種細胞異質性可能導致多種不良結果，包括診斷率低、治療效果不穩定和長期預后不良。細胞異質性的例子包括由于腫瘤細胞的體細胞突變而產生的克隆多樣性、腫瘤浸潤免疫細胞之間的基因組變異，以及T細胞和B細胞克隆的病原種群，所有這些都會影響臨床特征（1-4）。

單細胞基因組學是將下一代測序技術應用于單個細胞。開創性的單細胞基因組學研究有潛力表征臨床相關的細胞異質性，并改善臨床實踐。自2009年首篇單細胞測序論文發表以來，單細胞技術的進展迅速加速，得益于可以并行生成成千上萬個細胞的高精度數據的平臺的開發和商業化。目前已經有大量的單細胞方法用于檢測多種基因組特征，包括DNA甲基化、染色質可及性和其他表觀遺傳標記，但在這里我們關注的是迄今為止最適用于立即臨床轉化的單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞DNA測序（scDNA-seq）。這些高通量系統是穩健的、易于操作的，并且適合在診斷實驗室和臨床試驗研究中使用（5,6）。

確定數千個單個細胞的基因組特征具有潛在的臨床醫學應用。然而，我們認為，血液學、腫瘤學和免疫學領域將是首先從將細胞基因組學技術整合到臨床環境中獲益最多的領域，原因有三：細胞異質性的不利影響在臨床上是可觀察的，留下了對患者護理改進的高需求；存在大量的發現性研究和臨床前工作，展示了單細胞方法如何揭示疾病的新生物學基礎，并提出了用于診斷和隨后的靶向治療的途徑；以及相對容易獲得信息豐富的生物樣品（如血液或腫瘤組織）和獲取活檢樣品的既定實踐。

在該篇文章中，我們討論了細胞基因組學方法，特別是scRNA-seq和scDNA-seq，將如何在臨床上產生影響，重點關注腫瘤學、免疫學和血液學的應用。我們簡要描述了相關的概念和方法，突出了最有可能影響臨床實踐的最新研究，討論了將單細胞測序從研究環境轉化到臨床使用所需的下一步，以及在診斷實驗室使用這些技術所面臨的挑戰。

臨床轉化單細胞方法

生成具有臨床應用價值的單細胞序列數據有三個主要步驟（圖 1）：以標準化的方式收集和處理組織樣本，保持細胞的基因組特征；生成高特異性和高靈敏度的單細胞序列數據；最后，應用生物信息學方法將原始序列數據轉化為臨床可解釋的發現。

圖1 | 實施單細胞測序技術的關鍵步驟。樣本收集、單細胞測序和生物信息學的三個關鍵階段理想情況下應通過端到端的實驗室管理系統（LIMS）進行管理。a，組織樣本收集。對固體組織活檢樣本需要特別考慮，因為細胞必須分離成可活細胞懸浮液。對于液體活檢，細胞通常需要從樣本的其余部分中分離出來。單細胞懸浮液可以在單細胞RNA測序（scRNA-seq）或單細胞DNA測序（scDNA-seq）之前冷凍保存，從而顯著改善運輸物流和工作流管理。b，單細胞測序。有各種各樣的單細胞測序技術和平臺，主要使用基于板的或微流控系統。盡管基于板的方法在生成的數據深度方面有優勢，但我們預計，由于成本較低、工作流程更簡單、吞吐量更高以及在診斷實驗室實施的障礙較低，微流控系統將是臨床實踐中最容易采用的。c，生物信息學。與整體基因組學方法一樣，從單細胞測序產生的所有數據都需要在被解讀為診斷報告之前，從原始數據轉化為人類可讀的“處理過的”數據。盡管單細胞生物信息學與整體基因組學生物信息學分享許多步驟，但在質量控制步驟需要額外考慮，以確保只保留來自高質量細胞的數據。BAL，支氣管肺泡灌洗；CSF，腦脊液。

組織樣本收集

單細胞測序平臺需要準備單個細胞的懸浮液。盡管現在出現了允許從固定材料生成數據的檢測方法，但當前的方法要求細胞必須是活的并且完整的，以減小操作對它們基因組特性的影響。因此，對于實體組織來說，快速隔離和通過機械和/或酶消化溫和地分離成單個細胞類型是至關重要的。這應該盡可能地在標本收集時進行，通常在24小時內（7-12）。

液體活檢樣本，如血液，需要從其余成分中分離出相關的細胞部分。用于分離細胞的確切方案取決于目標細胞，但可能包括密度離心技術，使用磁性標記珠的磁性細胞分離，熒光激活細胞排序（FACS）和使用包括細胞表面標記物、大小和變形性等特征的微流體技術。其中一些方法已經在臨床環境中使用。例如，包括 Ficoll–Paque 或 Lymphoprep 的密度離心方法，用于從全血或骨髓中分離初級人類外周血單核細胞（13,14）。

一旦從液體組織中分離出細胞或從實體組織中分離，它們可以使用含有諸如二甲基亞砜這樣的冷凍保護劑的控制速率冷凍室和培養基進行冷凍保存。這增加了樣本收集和生成單細胞數據之間的物流和工作流的靈活性。在測序之前，細胞可以被解凍和洗滌，其活力可以通過染料排除法可靠地測試（15）。

無論下游分析類型如何，細胞隔離技術是相同的，盡管由于 DNA 與 RNA 相比的更高穩定性，scDNA-seq 對細胞準備工作流的變化更為穩健。簡單、經過驗證的單一組織類型的方案對于臨床轉化至關重要。現在已經存在針對大多數組織類型的基于研究的方案，但很少有實體組織細胞準備方案已經在臨床工作流中得到驗證。

生成單細胞數據

有許多可用于 scRNA-seq 的方法。然而，對于臨床實踐，平臺必須發展成更加用戶友好、高通量和經濟高效。捕獲細胞中的 RNA 的技術可以分為微流體或板基方法，這取決于細胞是如何被隔離的。它們在成本、每個實驗的細胞數量和易用性方面有所不同（表 1）。

表1 | 可用文庫制備和捕獲方法的總結

基于微流體的方法涉及將細胞封裝到與 DNA 條形碼珠一起的油滴中，這些珠子會捕獲來自細胞的 RNA。然后為所有細胞生成 cDNA 并使用標準的下一代測序工作流進行測序。使用結果數據，可以通過使用條形碼將 RNA 序列分配給單個細胞的生物信息學分析來確定單個細胞的 RNA 概況。微流體和微孔技術使得可以同時捕獲成千上萬個細胞，市場上有幾個商業平臺，包括 10x Genomics Chromium Controller、BioRad ddSeq、ICELL8 或 BD Rhapsody Lab。低通量的板基方法，如 Smart-Seq3，涉及使用手動選擇或 FACS 在標準的 96- 或 384-well 板中隔離細胞。這些板用于執行高保真逆轉錄、模板轉換和預擴增，以增加 cDNA 的產量。接下來，cDNA 文庫被測序，使用與微流體系統中使用的類似的生物信息學技術確定 RNA 概況（16-19）。

除了捕獲方法和涉及的細胞數量外，微流體和板基方法之間的關鍵區別之一是它們生成的轉錄組覆蓋率。基于微流體的 scRNA-seq 方法通常使用 3' 或 5' 捕獲和斷裂方法，基本上提供轉錄分子的計數，但缺少諸如異構體變異和等位基因特異性表達等復雜信息。相反，板基方法生成關于整個轉錄組的序列信息，也稱為全長轉錄本。盡管板基方法提供了額外的信息，如 RNA 剪接和異構體變異，細胞特性，如大小，細胞表面表達和散射性質，但它們在易用性和通量方面有顯著的權衡。除非這些屬性有重大變化，否則不太可能在臨床工作流中實施全長單細胞轉錄方法。

scDNA-seq 使研究人員能夠閱讀基因組并在細胞水平上識別單個突變，如拷貝數異常和單核苷酸變異。盡管這些信息可以從轉錄組數據中推斷，但這種數據類型的有限基因組覆蓋意味著變異的估計通常不夠準確。與 scRNA-seq 相比，scDNA-seq 技術較不成熟，目前市場上的商業解決方案很少（表 1）。

表1 | 可用文庫制備和捕獲方法的總結

scDNA-seq 分析已經在 Mission Bio Tapestri 平臺上有效地展示過。這是一個定向的、高通量的基于滴式的系統，對于多達 5000 個細胞，其讀取覆蓋率> 90%，它被開發出來用于改善癌癥中的患者分層、治療選擇和疾病監測。然而，僅僅基因分型并不能提供關于細胞身份或檢查例如細胞分化和功能所需的其他表型信息。多模式測序（生成單細胞 DNA、RNA 和表觀遺傳信息）是解決這個問題的一個有吸引力的方法，它使得可以將體細胞突變與細胞的基因組特性聯系起來。此外，單細胞 T 細胞受體（TCR）和 B 細胞受體（BCR）測序提供了一種獨特的方法來檢查免疫細胞組，并可以識別克隆擴增和多樣性（20-26）。

目前，像 10x Genomics 和 Mission Bio 這樣的單細胞技術正在臨床實驗室中出現，盡管可訪問性有限。這些技術在國家質量控制框架內的標準化和認證是結果可靠性所必需的。單細胞方法必須與當前應用的現行金標準測試進行比較。例如，scRNA-seq 在識別微小殘留疾病（MRD）方面的靈敏度和特異性將需要直接與當前用短串聯重復（STR）PCR 檢測水平進行比較。

生物信息學分析

一旦生成了序列數據，就會應用標準的生物信息學技術來轉換原始數據并提取臨床相關信息。這些步驟通常會成為驗證和法規框架的一部分。計算步驟取決于序列數據是來自scRNA還是scDNA，典型的生物信息學步驟的深入評論已在其他地方發表過。我們預計，在大多數情況下，這些流程將適用于臨床設置，但與分子工作流程一樣，它們將需要在本地認證框架內進行驗證（27-29）。

總之，盡管使用單細胞測序生成臨床可行的數據存在相當多的障礙，但這些障礙并非不可逾越（補充表1），我們預計，單細胞基因組學能夠為臨床護理提供的益處，再加上快速的技術發展以最小化樣本管理的成本和物流，將在未來幾年中導致更廣泛的應用。

補充表1 | 在診斷實驗室實施細胞組學的實際考慮

單細胞技術在臨床試驗中的最近增長（框1和補充表2）是對這項技術如何可能被整合到臨床研究和實踐的有價值的預測。像人類細胞圖譜這樣的開源參考數據集的日益可用，將有利于生物信息學程序的驗證，并增強細胞識別和分析。下文中，我們突出了一些即將進行臨床轉化的引人注目的應用實例（30）。

框1?細胞基因組學在臨床試驗中的變化作用

截至2022年12月，已有62個注冊的臨床試驗在腫瘤學、血液學和免疫學領域采用細胞基因組學方法（見補充表2）。這些試驗中的大多數都有探索性目標，例如發現生物標記物以便與標準治療試驗一同使用，或改進疾病的診斷和亞分類（如下方“應用領域”表中所總結的）。盡管探索性研究仍然至關重要，但明確專注于單細胞RNA測序（scRNA-seq）的實際應用以及其在診斷環境中使用的可行性的試驗最有可能推動其在臨床實踐中的應用。

有趣的是，當前大多數試驗都在使用scRNA-seq，或者是結合scRNA-seq和單細胞DNA測序（scDNA-seq），這可能反映了這項技術的成熟度，因為scDNA-seq在腫瘤學和血液學方面有著巨大的臨床機會（如下方“測序類型”表中所總結的）。值得注意的是，這些臨床試驗中有85%主要是使用血細胞進行的，或者，在實體組織癌癥的情況下，使用血細胞和腫瘤細胞的配對樣本（補充表2）。這部分可以解釋為實體組織解離仍然存在的挑戰，盡管使用配對樣本將實現驗證研究，從而減少對實體組織活檢的需求。我們預計這將很快成為臨床試驗設計的固有組成部分。

補充表2

補充表2 | 利用單細胞技術的所有當前開放的臨床試驗匯總。NHL – 非霍奇金淋巴瘤，ALL – 急性淋巴細胞性白血病，HSCT – 造血干細胞移植，GVHD – 移植物抗賓主病，AML – 急性髓系白血病，DLBCL – 彌漫性大B細胞淋巴瘤，CSF – 腦脊液，BM aspirate – 骨髓抽吸，CRC – 結直腸癌，NSCLC – 非小細胞肺癌，GBM – 多形性膠質母細胞瘤，HNSCC – 頭頸部鱗狀細胞癌，HCC – 肝細胞癌，NET – 神經內分泌腫瘤，ILD – 間質性肺病，HIV – 人類免疫缺陷病毒，NMO - 脊髓灰質炎光譜病，MG – 重癥肌無力，CIDP - 慢性炎癥性脫髓鞘多根神經病，GI – 胃腸道，scATAC-seq – 單細胞轉座酶可及染色質測序檢測

單細胞基因組學在血液病學中的應用

血液系統惡性腫瘤的特點是細胞異質性，而像治療耐藥細胞克隆和白血病干細胞這樣的稀有細胞群體對疾病軌跡有著關鍵意義（圖 2a）。

圖2 | 單細胞測序在研究中的進展。單細胞測序對生物科學研究產生了巨大影響，特別是在揭示涉及人類疾病的細胞的新類型和功能方面。a，在血液學方面，追蹤克隆演化使得能夠識別治療抵抗性克隆和進行長期疾病監測。通過它們的基因組特征定義低頻細胞群體的識別，也推進了對腫瘤干細胞和最小殘留疾病監測的研究。b，在腫瘤學方面，幾乎所有類型的癌癥的細胞圖譜都已經發表，這些圖譜描繪了腫瘤內異質性和腫瘤微環境。與此相一致，人們在了解轉移機制和通過循環腫瘤細胞的分析進行早期檢測方面取得了重要進展。c，在免疫學方面，通過解析單個細胞的T細胞受體和B細胞受體測序，研究人員已經解析了潛在的致病免疫細胞的基因組機制，這些細胞可以是循環的，也可以是組織駐留的。與傳統的流式細胞術技術相比，單細胞基因組方法在可以測定的參數數量上提供了數個數量級的增加，大大提高了發現的分辨率。

這些惡性腫瘤很容易適用于單細胞基因組學方法，因為從血液、骨髓和淋巴結創建單細胞懸浮液的標準化協議已廣泛可用。實際上，血液科醫生已經使用諸如流式細胞術和質譜細胞術的單細胞水平分析進行診斷，但這些方法僅限于分析少量蛋白質的表達。在這里，我們討論了通過引入更高分辨率的細胞基因組學技術，可能改進的臨床實踐領域，這些技術可以將 plex 增加 100 倍，并具有比當前方法更高的定量準確性。

提高診斷和治療選擇的分辨率

新興研究已經展示了單細胞測序改進血液系統惡性腫瘤診斷技術的潛力。一個關鍵的例子是 FLT3（FMS樣酪氨酸激酶3）基因在急性髓系白血病中的早期診斷突變，這是一個眾所周知的預后不良特征，與新興的靶向治療相關。對 FLT3 突變的測試在診斷時可能是陰性的，但在復發時是陽性的，這表明初始細胞群體中的突變水平低于當前常規檢測方法的檢測限制。最近的工作表明，scDNA-seq 即使在稀有細胞群體中也能夠識別 FLT3 突變，比 bulk 測序提高了一個數量級的檢測水平。我們認為，細胞基因組學技術可以在兩個主要領域改善攜帶 FLT3 突變患者的管理。第一個是提高精確的早期診斷，因為針對這種突變的現有靶向治療將有助于避免克隆擴張和疾病進展。第二個是疾病監測，因為從診斷到復發階段對 FLT3 突變的克隆演化的準確信息可能有助于指導最合適的治療決策（31-33）。

使用細胞基因組學分析單個細胞的能力也顯示出作為一種敏感方法來早期診斷異源性（供體和受體細胞的基因型都存在）的潛力，這種方法用于白血病患者進行異基因干細胞移植后。測試異源性在幫助評估供體植入、檢測排斥反應的早期跡象和監測最小殘留疾病（MRD）方面具有重大臨床價值。當前檢測異源性的金標準方法包括使用 PCR 測試諸如短串聯重復（STRs）這樣的高度變異基因型，這可以保證1%的檢測靈敏度。然而，使用更敏感的方法進行更早的檢測可能通過使得更早的治療干預成為可能而改善臨床結果。基于宿主和供體轉錄組的差異，scRNA-seq 已經顯示了在異基因干細胞移植后皮膚依然存在的宿主 T 細胞。盡管目前尚未發表，但隨后的研究表明，與 STR 分析相比，scRNA-seq 在檢測未成熟細胞群體中宿主細胞水平方面具有顯著更高的靈敏度。一項臨床轉化的初步研究顯示，scDNA-seq 通過準確量化宿主和供體細胞的基因型比例，可以跟蹤植入和異源性。這些測試對于在異基因干細胞移植后1-2個月識別突變的 TP53 克隆足夠敏感，這成功地預測了復發，當常規測試如爆發計數未檢測到疾病進展時（34-39）。

單細胞測序還可能增強對以血細胞群體中體細胞嵌合體為特征的血液疾病的診斷，包括諸如 Fanconi 貧血或重型再生障礙性貧血這樣的低細胞性疾病。在這些情況下，嵌合體的程度和基因組位置與疾病進展的長期率和總體預后密切相關。當前檢測嵌合體的臨床方法使用 bulk DNA 測序，其基因型依賴于測序覆蓋率和雜合子的比例。然而，通過使用高通量單細胞測序，可以顯著增加檢測的靈敏度和準確性，同時可以分析更大的細胞群體來提高統計學的準確性。例如，對 Fanconi 貧血患者的單細胞 RNA 測序發現了多個基因型的存在，并與多樣性和臨床結果密切相關（40）。這導致了對嵌合體的低估，這在疾病的早期階段或當無法進行細胞隔離時是無法檢測的。直接應用scDNA-seq，主要使用目標捕獲panel，將解決這兩個挑戰。

細胞基因組學還為改善靶向治療和理解治療對克隆演化的影響提供了新的機會。這個活躍的血液學研究領域已在表征異質性疾病（如髓系發育不良綜合癥、急性髓系白血病、骨髓衰竭和多發性骨髓瘤）方面取得了實質性進展。特別是，定義分子和基因特性以及識別治療克隆選擇已經取得了重大進展。這些研究中出現了一些反復出現的主題：第一是識別治療誘導的克隆演化，第二是識別導致克隆演化和細胞行為變化的獲得性突變。挑戰在于推斷血細胞中觀察到的任何克隆事件的后果——稱為具有不確定潛能的克隆性造血（CHIP），其中體細胞突變固定在少量細胞中。通過單細胞分辨率的深度多組學分析，可以改善區分與年齡相關的良性變化與早期惡性轉化的能力，這歸因于人類造血干細胞的轉錄組、蛋白質表達和表觀遺傳標記之間的不一致性。盡管整體方法可能敏感地檢測到CHIP突變的存在，但需要對個體細胞進行表征，以確定惡性轉化的確切潛能和發病機制，以適當地對患者進行分層。在髓系發育不良綜合癥中，顯著的腫瘤內異質性與低細胞性結合，表明單細胞方法是表征疾病生物學的理想選擇（41-48）。

特別關注確定體細胞克隆突變的順序，早期工作展示了通過軌跡推斷的克隆演化。通過識別關鍵的早期主干突變，可以使用針對惡性細胞亞克隆的特異性藥物。最明顯的例子之一是急性髓系白血病，其中scDNA-seq已能夠在治療過程中和復發時繪制驅動突變的克隆擴張，以確定對持續存在的治療耐藥細胞亞克隆的患者進行適當的治療加強。同樣，scRNA-seq已被用于評估白血病干細胞，這些細胞是表型上類似于健康造血干細胞的原始和靜止亞群，但在急性和慢性髓系白血病中是治療耐藥的。此外，scRNA-seq可以表征B細胞急性淋巴細胞性白血病中MRD中的稀有細胞，包括分化狀態和基因上調，具有識別治療靶點的潛力（48-54）。

改進最小殘留疾病的檢測

單細胞分析在檢測最小殘留疾病（MRD）方面具有臨床應用價值，無論是在進行誘導化療或骨髓移植治療血液惡性腫瘤后。MRD的檢測指導治療選擇，改進的監測率將導致有益的臨床結果和治愈的機會。例如，近期已經證明，scDNA-seq可以在急性髓細胞白血病治療后識別MRD。scDNA-seq在細胞克隆分型的準確性使其達到了0.02%的低檢測限，每位患者測序約8000個細胞（超過歐洲白血病網聯盟1/1000細胞的檢測限制），并比bulk下一代測序以更高的頻率檢測復發性MRD。與當前多重定量PCR檢測的臨床標準相比，scDNA-seq可以提高準確性和簡便性。然而，在該技術能夠變得容易進入臨床之前，需要超高通量的方法，每位患者生成數十萬個細胞的數據（見圖3）（54-55）。

單細胞基因組學在腫瘤學中的應用

單細胞技術在實體癌癥中的應用在許多方面與血液惡性腫瘤的應用原理相同。當今癌癥治療的主要方式是多模態治療，包括手術、化療、免疫治療和放療。盡管這對一些患者有效，但對許多其他患者來說，這些治療的臨床效益有限，并導致治療相關的發病率。此外，眾所周知，包括治療耐藥性、復發和毒性在內的各種臨床結果，是由腫瘤、基質和免疫細胞群體之間的腫瘤內異質性導致的。在臨床環境中，腫瘤內異質性帶來了幾個挑戰，例如阻礙了對治療耐藥亞克隆的早期反應。此外，無法準確測量分子驅動因子和癌癥干細胞的比例影響了治療的效力。傳統的bulk測序診斷技術難以量化這些特征，因為稀有細胞群體的基因組特征被掩蓋了，推斷腫瘤的細胞組成不精確。因此，單細胞測序技術有望在癌癥領域產生臨床影響，特別是通過解析實體組織腫瘤中細胞的分子信息和組成，更高分辨率的循環腫瘤細胞（CTCs）基因組分析和惡性細胞的精確克隆分型。我們預期，腫瘤學的幾個領域，包括早期診斷和篩查、導向性治療和針對腫瘤微環境的治療，將受到細胞基因組學技術的影響（見圖2b）（56-60）。

使用循環腫瘤細胞進行早期診斷和疾病監測

CTCs是從原發腫瘤中脫落，并出現在循環血液或淋巴系統中的腫瘤細胞，以單個細胞或小細胞團簇的形式存在。一旦進入循環系統，CTCs最終遷移到體內新的部位，要么保持休眠，要么形成轉移瘤。盡管CTCs很少見 — 通常每1-1000萬個白細胞中檢測到一個CTC — 但有幾種方法可以檢測到并從血液中分離CTCs。一旦分離，單細胞測序技術可以揭示有價值的臨床見解。最近的研究表明，通過仔細過渡到臨床實驗室，單細胞測序CTCs可以用于患者的早期檢測，監測對治療的反應，并可能指導治療選擇（61-65）。

重要的是要認識到，已經使用流式細胞術等技術在這些領域取得了改進，通過細胞表面標記物（如EpCAM）或癌癥特異性生物標志物來識別和量化CTCs的豐度。例如，基于流式細胞術監測CTCs的存在已經被證明是一種寶貴的策略，對于腫瘤的重要早期檢測尤為如此，特別是在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝細胞癌、胰腺癌、結直腸癌和黑色素瘤中。然而，通過將單細胞基因組學技術應用于CTCs，可以獲得更多數據，從而改善臨床信息和結果。例如，單細胞測序已被用于識別乳腺癌患者中CTCs的增殖率差異，高增殖率與不良預后相關。同樣，在從結直腸癌患者分離的CTCs中，單細胞測序識別了與細胞黏附和運動相關的基因組異質性。與更大的移動性和黏附性相關的簽名與增加的死亡時間相關。在這兩種情況下，細胞基因組學技術都識別了細胞表型 — 增殖和黏附 — 這些表型是傳統的基于生物標志物的方法無法識別的（66-71）。

來自CTCs的基因組信息也可以用來幫助定制治療方案。例如，對CTCs和原發腫瘤的轉錄組進行詳細比較，已經確定了使CTCs能夠在血流中存活并發展為轉移性疾病的分子表型，為防止疾病傳播提供了不同的治療靶點。在實際應用中，CTCs的準確識別和基因組分析將使臨床醫生能夠準確地監測早期癌癥的復發，確定后續治療的靶向治療策略，無需連續組織活檢，也可能允許對無法進行組織活檢的腫瘤進行準確的首次診斷。此外，還可以實時用CTCs進行治療耐藥細胞的早期識別，實現實際的治療定制和預后判斷（72-75）。

通過分子篩查引導治療

細胞毒性化療藥的選擇歷史上一直是由腫瘤部位和組織病理學特征的臨床試驗驅動的，而不是由細胞或基因組特征驅動的。然而，發現驅動突變和采用口服小分子酪氨酸激酶抑制劑或單克隆抗體的靶向治療已經革命性地改變了許多癌癥的治療，例如人表皮生長因子受體2（HER2，由ERBB2基因編碼）陽性乳腺癌和表皮生長因子受體（EGFR）突變的非小細胞肺癌。最近的策略是組織不同源的靶向治療，治療決策由分子特征決定，而不考慮組織來源。例子包括微衛星不穩定性的免疫治療或神經營養性酪氨酸激酶（NTRK）融合陽性腫瘤的entrectinib治療。這些策略基于從bulk測序方法識別的基因組特征，因此嚴重依賴于活檢樣本的細胞組成和解析多個細胞群體的基因組特征的能力。此外，即使平均蛋白質或基因組信號識別出相同的基因擴增，針對不同癌癥中的相同分子驅動因子的靶向已被顯示具有可變的結果，部分歸因于局部細胞微環境的差異。例如，HER2定向治療顯著延長了乳腺癌的總生存時間，但在胃癌中的療效有限，這與證實胃癌中存在多樣性和耐藥細胞群體的數據一致。在這些情況下，單細胞技術可以識別可靶向細胞的流行病學，并可用于基于腫瘤異質性制定個性化治療決策（76-81）。

除了腫瘤中的轉錄異質性外，遺傳異質性（又稱為克隆性）也很常見。因此，基于bulk測序的分子引導治療選擇可能會錯過腫瘤中的一些克隆。當可靶向突變僅存在于稀有克隆群體中時，這尤其正確。在這些情況下，基于panel的scDNA-seq可以提供比bulk測序方法更顯著的優勢，罕見克隆型的檢測率是測序細胞數的函數。更細致了解腫瘤內克隆的遺傳輪廓可用于指導靶向和聯合治療。

與提供腫瘤的克隆結構信息同時，scDNA-seq還可以繪制疾病的克隆演化，這作為縱向監測工具很有用，用以確定不同的細胞子克隆如何響應治療，并描述從原發疾病到轉移部位的異質性。在一系列癌癥中，已經觀察到治療響應中克隆演化識別的有力例證，包括乳腺癌中克隆的治療依賴性選擇，結直腸癌中的獲得性突變以及在用KRAS抑制劑治療肺癌后出現的克隆抵抗異質性模式。我們預計，基于panel的scDNA-seq的臨床應用將側重于分子引導治療選擇，并且由于建立良好的測試程序和使用bulk測序方法進行基因組信息決策，而定位于快速臨床轉化。例如，假設一個腫瘤有一個帶有ERBB2擴增的子克隆，但只代表了較小比例的細胞。在這種情況下，有可能靶向治療只會影響腫瘤細胞的一部分。因此，受影響的腫瘤細胞的閾值可能預測總體治療效果（82-84）。

細胞水平的基質細胞和浸潤免疫細胞分辨率

免疫治療已經改變了許多癌癥的治療格局，例如轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌。然而，在當前實踐中，只有一小部分患者能夠獲得持久的益處，還需要發現能有效預測患者反應的生物標志物。最常見的免疫組化試驗用于免疫檢查點調節蛋白PDL1，可以在腫瘤細胞或腫瘤浸潤免疫細胞上使用；然而，在具有復雜微環境和高免疫浸潤的腫瘤中，其有效性會減弱。解決腫瘤內部和微環境異質性一直是單細胞研究中的一項激活領域，大多數實體癌癥已經進行了基質細胞和浸潤免疫細胞的詳細單細胞檢查。其中，越來越多的研究表明，特異于細胞亞型的基因組特征可以預測檢查點抑制劑免疫治療的反應和毒性（圖3）。雖然生成實施這些新生物標志物方法所需的單細胞數據類型仍然是一個挑戰，但我們相信，由于生物標志物的細胞分辨率帶來的優勢，免疫治療的療效會得到提高，特別是對于像透明細胞腎癌和非小細胞肺癌這樣具有復雜細胞生態系統的癌癥（85-91）。

圖3 | 將單細胞測序集成到臨床實踐中的好處。盡管我們預計從長遠來看，單細胞基因組學很可能會影響臨床實踐的許多領域，但我們預計最初的重點領域將是腫瘤學、血液學和免疫學。a，單細胞技術可通過提高應用于循環腫瘤細胞的基因組分辨率來用于癌癥的早期檢測。b，越來越多的證據表明，特定免疫細胞亞群的細胞基因組特征可以用來預測檢查點抑制劑免疫療法的反應和毒性。c，細胞基因組學技術可以識別作為獲得性免疫療法抵抗機制的靶向HLA的選擇性轉錄喪失。d，在一系列應用領域中，細胞基因組學技術在臨床試驗中的應用正在增長（見補充表2）。e，從最小殘留疾病的分辨率提高到患者的亞分類和分層，診斷和監測的應用正在出現。f，細胞基因組學方法正被用來通過分辨克隆型和細胞亞群的基因組特征來識別新的治療靶點。g，除了早期檢測，深度基因組分析循環腫瘤細胞還可以用于監測癌癥的演化。

通往臨床轉化更直接的途徑涉及識別特定亞型的細胞，其存在和流行可以預測對免疫檢查點阻斷療法的反應。最近一個明確的例子是通過對五種癌癥類型的scRNA-seq數據進行元分析，發現CXCL13+CD8+ T細胞與對抗PD1療法的有利反應之間的相關性。通過分析帶有T細胞抗原特異性信息的scRNA-seq數據，顯示測量CXCL13表達可以有效識別腫瘤內耗竭和非耗竭的腫瘤反應性CD8+ T細胞克隆。這種方法，將腫瘤反應性T細胞的基因組特征與旁觀者T細胞分離，展示了單細胞技術相對于bulk方法所提供的更高分辨率帶來的好處。一旦發現了細胞的特征——在這種情況下，是CXCL13+和CD8+——傳統的細胞分型技術如流式細胞術和質譜法可以用于常規臨床實踐（92）。

探索免疫治療耐藥機制和采用T細胞治療的發展是單細胞方法為免疫腫瘤學領域做出貢獻的另外兩個領域。例如，與免疫組化或bulk測序方法不同，scRNA-seq可以識別靶向HLA的選擇性轉錄喪失作為獲得性免疫治療耐藥的一種機制，從而實現針對性藥物開發策略，以克服治療耐藥性（93）。

采用T細胞治療，即輸注特異性靶向癌癥抗原的基因修飾T細胞，是高度個性化免疫腫瘤學的巔峰，并有望極大受益于將細胞基因組學轉化為臨床實踐。單細胞TCR重排序列測序（scTCR-seq）結合scRNA-seq提供的外周血和腫瘤浸潤淋巴細胞中異質性新抗原特異性TCR的快速和準確識別，表明這將是進一步發展該療法的技術選擇。此外，scRNA-seq識別癌細胞中的非遺傳異質性的能力，包括細胞狀態轉換，可以允許針對比當前的bulk TCR測序技術識別出來的更廣泛的癌癥新抗原進行靶向治療（94-97）。

單細胞基因組學在免疫學中

自從50多年前首次報道T細胞和B細胞之間的區別以來，免疫學領域一直致力于將淋巴細胞和其他免疫細胞進一步細分為越來越多的亞群，以確定它們在健康和疾病中的功能。通過解決這些群體內的異質性和多樣性，單細胞分析已經迅速推進了這一工作，并生成了一個快速演變的循環和實體組織中免疫細胞圖譜。scRNA-seq方法的一個獨特特性是，可以從單個淋巴細胞確定TCR和BCR序列，使它們對研究免疫學疾病具有價值。TCR和BCR特異性是針對病原體的正常免疫反應的基礎，但是對自抗原的非典型反應會導致自身免疫疾病，而對致敏原的特異性反應則會導致臨床過敏癥。目前，大多數過敏性和自身免疫性疾病的治療基于非特異性的免疫抑制和免疫調節劑，這些劑會損害病原性和正常免疫克隆。當前的scRNA-seq研究有潛力使臨床醫生能夠表征病原性克隆，使用它們的TCR和BCR序列作為明確的識別條形碼，并使用它們的基因組特征來使用新的或現有的治療劑有選擇性地靶向細胞（圖2c）（98-99）。

疾病生物學的特征描述

自身抗體的產生和自反應性T細胞的出現導致了自身免疫性疾病。這些都是系統性疾病，但一些疾病表現為特定組織的炎癥。scRNA-seq研究主要關注局部炎癥反應或對自抗原的異常系統性免疫反應。將單細胞測序應用于來自血液、腦脊液和炎癥組織活檢的細胞，已經在表征與疾病相關的細胞群體方面取得了重要進展，包括在類風濕性關節炎、狼瘡性腎炎、銀屑病性關節炎、多發性硬化癥和炎癥性腸病等病癥中，鑒定組織浸潤免疫細胞。這些群體的特征表征導致了新免疫亞集的發現，包括T輔助細胞，這些細胞被認為是組織常駐的、驅動自抗體產生的自反應性T輔助細胞，它們的循環對應物在幾種自身免疫性疾病中都得到了證實。這些群體的新研究正在計劃或進行中，以確定它們的病原性和在治療選擇中的重要性。scRNA-seq在鑒定對標準治療有抵抗性的類風濕性關節炎的潛在治療靶點方面表現出實用性。在一個引人注目的過敏性疾病例子中，scRNA-seq用于表征一位患有嚴重、難治性藥物反應伴嗜酸性粒細胞增多和全身癥狀（DRESS）綜合癥的患者體內擴增的、多克隆T細胞群體。從受影響皮膚的淋巴細胞分析揭示了它們的高活化狀態，由JAK3和STAT1的上調驅動。這反過來建議了JAK抑制劑tofacitinib作為一種治療選項，這對減輕疾病負擔產生了顯著效果（100-110）。

對致病性自反應性TCR和BCR組合的scRNA-seq研究表明了不同疾病所特有的克隆性和細胞異質性。例如，研究導致1型糖尿病（T1DM）的致病性T細胞，表明T1DM是由于各種各樣的致病性免疫細胞引起的；因此，針對單一TCR序列的療法將不會有效。另一方面，scRNA-seq被用來展示在先前定義的亞群（T輔助17細胞（TH17細胞））內的細胞異質性，以鑒定選擇性驅動自身免疫性腦炎的致病性細胞，這使研究人員能夠開發不會抑制健康免疫細胞的靶向治療。scDNA-seq在干燥綜合癥患者的致病性自抗體產生的B細胞中鑒定了淋巴瘤驅動基因的體細胞DNA突變。這表明了免疫耐受檢查點逃逸的一種機制，并表明一些自身免疫性疾病可能代表淋巴樣腫瘤的前惡性狀態。在類風濕性關節炎和多發性硬化癥患者的CD8+ T細胞中也鑒定出了體細胞DNA突變。自身免疫性疾病的發病機制和基礎機制仍然理解不足。單細胞方法研究免疫系統并精確鑒定淋巴細胞克隆的能力可能會徹底改變我們對這些復雜疾病的診斷和治療方法（111-114）。

當前的障礙和未來的方向

目前，單細胞基因組學的已發表工作仍然堅定地處于研究領域。我們重點關注我們預期可以轉化為臨床實踐的應用。然而，我們下面提到了幾個重要的——但并非無法克服的——臨床實施必須首先克服的障礙。

樣本采集、儲存和處理

大多數細胞技術要求新鮮的、活的細胞進行測序。盡管總是擔心患者會覺得重復進行活檢檢測的想法令人生畏，但研究確實表明，如果這會影響他們的護理，患者愿意這樣做。為了實現細胞捕獲和測序，需要前期投資設備和人員，處理樣本、準備文庫和運行適當的分析需要技術專長。此外，還需要員工培訓和認證，以滿足嚴格的質量要求。

新鮮的組織活檢樣本必須迅速進行細胞測序，通常在幾小時內。這將需要臨床病理實驗室擺脫甲醛固定的范式轉變。盡管這代表了一個重大的變化，但可以從1980年代流式細胞術引入臨床實踐中吸取經驗教訓。為流式細胞術收集的樣本在特定的培養基中收集，并在實驗室內快速分析。專業人員、技術進步和自動化報告已經使這些結果成為多個領域臨床醫學的常規部分。在細胞基因組學領域，已經出現了一些將平滑實施過程的新興技術，包括商業上可獲得的冷凍培養基、患者樣本的多重化和細胞RNA固定技術。

生物信息學分析

以可復制、高效的方式處理數據是將細胞技術應用于臨床的一大障礙。為了實現結果的可復制性，實驗室必須有標準的細胞過濾和標準化過程。此外，使用參考數據集的自動細胞分類將確保結果的穩健性。在大多數國家，新技術都是在國家法規框架內進行標準化和驗證的（例如澳大利亞的國家測試機構協會），并且敏感性和特異性都是以當前的金標準測試為基準的。最初，具有豐富經驗的參考實驗室應處理數據，隨著臨床需求的增加，可以分享專業知識（115）。

結果的返回給臨床醫生

將大量的細胞基因組數據壓縮成清晰、簡潔且臨床有用的報告是必要的。全外顯子測序已在腫瘤學中變得普遍，有一些指南幫助實驗室將報告定制給臨床醫生。盡管在細胞領域會有新的挑戰，因為報告還必須考慮到細胞異質性，但當前可用的指南將提供有用的框架（116）。

成本

雖然目前細胞技術的成本相對較高，但我們從全外顯子測序中看到這些成本隨時間可以降低。根據國家人類基因組資源研究所的數據，在21世紀初，測序一個人類基因組的成本約為100萬美元，而20年后，這一成本不到1000美元。細胞技術各方面的技術、方法、策略和試劑的進步將隨著這些方法融入臨床而降低成本。

結論

單細胞分辨率的基因組測序革新了我們對血液學和實體器官惡性腫瘤的理解。它描繪出腫瘤異質性和微環境，識別出多個組合治療的靶點，預測對治療的反應和毒性，并揭示治療抗性的機制。單細胞測序在開發自身免疫疾病的精準治療方面表現出潛力，也用于患者分層、疾病監測和精確診斷（圖 3）。未來的研究應優先尋找解決財務和法規障礙的實際解決方案，以實現這項技術的廣泛臨床應用。評估單細胞測序在診斷和識別可靶向突變以指導治療決策方面的能力的臨床試驗將是其轉入臨床實踐的關鍵。

可行性試點試驗應專注于為新鮮組織收集和快速處理制定一致的協議，以及簡化的數據分析流程，以確保結果以標準化的格式呈現給臨床醫生。例如，終點可以包括在指定時間內處理的樣本數量或臨床醫生對結果格式的滿意度。此外，還應收集從組織收集到生物信息學處理的成本、人員和基礎設施需求的數據，以指導未來的發展和投資。展示可行性至關重要，因為如果這一點沒有確定，就很難證明進行更廣泛的試驗來評估效能和有效性是合理的。

這些學科中的大多數當前臨床試驗仍處于探索階段，只有一項研究專門檢查了可行性。下一個挑戰是將單細胞技術從實驗研究轉移到具有實際應用的臨床試驗，以評估可行性和效能。此外，當前識別新治療靶點的研究需要轉化為藥物開發和實踐。

我們預測，對診斷和治療目的的臨床效益的試驗證據將改變我們對精準醫學的方法，并且單細胞測序將在未來十年成為診斷過程的關鍵組成部分。

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