熒光素酶報告基因檢測的操作步驟
熒光素酶檢測系統，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細胞中的熒光素酶，用其底物來檢測熒光素酶活性。檢測步驟如下：
1.?加裂解緩沖液裂解轉染的細胞。
2.?將上述裂解物轉移入微孔板或者試管中（根據檢測的需要選擇所用器材類型）。
3.?加入含有所有酶反應成分（必須包括底物熒光素），使化學發光反應開始。
4.?使用熒光儀或者液閃計數儀檢測所發射的熒光。
實驗步驟：
注：該操作流程通常用來檢測轉染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性，不適用于對細菌熒光素酶進行檢測。
1．實驗第一天，消化并接種細胞（根據具體實驗選擇合適的細胞）于35mm細胞培養皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養箱內培養過夜。
2．等細胞密度達到70％時用Luciferase報告基因質粒、LacZ的表達質粒及其它質粒（根據具體實驗確定）共轉染細胞（根據具體實驗選擇轉染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。
3．轉染24－36h后，吸去培養液，用預冷的PBS（無鈣和鎂離子）洗滌細胞。
注：熒光酶的酶促反應會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉染的細胞在收集細胞前應充分洗滌除去含鈣介質。
4．在每個培養皿中加入350μl預冷的harvest buffer,于4 ℃或冰上放置10min裂解細胞。
5．在細胞裂解期間，準備足量的1.5 ml微量離心管，將ATP buffer 與luciferin?buffer 以1：3.6比例混合成反應液后分裝，每管100μl。
6．依次取等體積的細胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發光儀（Luminometer）上讀取吸光值。
注：發光反應會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應液后5s內必須讀取吸光值。
7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。
8．取剩余裂解液測定LacZ的活性，其讀數作為內標用以矯正熒光素酶的讀數。
9. 用矯正后的讀數作圖，分析數據。
注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應丟棄。
注意事項：
1.熒光素酶檢測試劑需在15-25℃條件下預平衡后再進行反應，而后依據具體條件進行自動或手動檢測。當用液閃計數儀時，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。
2.如果細胞裂解后不能立即對提取物進行檢測，樣品可以在冰上保存大約5h，在-70℃可保存數月。不要反復凍融以避免酶活性的降低。
3.利用上述方法檢測冷的樣品時，其信號強度將下降5-15%。
4.在熒光素酶活性較高的情況下，導致信號超出線性范圍（信號溢出）可用裂解液將樣品進行稀釋。
5.不要儲存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為2.5mg/ml，這樣可以保持樣品的穩定性。
6.一些熒光儀在進行檢測前需要1-2s的穩定，因此建議在開機后過一段時間再進行檢測操作。
