細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇與常見(jiàn)問(wèn)題解答（二）
(4)細(xì)胞分布不均及解決辦法
問(wèn)：我的細(xì)胞接種培養(yǎng)板，細(xì)胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊？我看園子里有的戰(zhàn)友的細(xì)胞卻是聚集在中間，是不是板子的質(zhì)量問(wèn)題??？
答：請(qǐng)問(wèn)你的細(xì)胞是如何混勻的？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話，很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分，導(dǎo)致細(xì)胞中間少，四周多！自己可是試試！
周邊一般是相對(duì)會(huì)多一點(diǎn)，但是中間的數(shù)量也不會(huì)很少啊~~ 鋪板的時(shí)候我也沒(méi)有特異去振蕩培養(yǎng)板。
大概是板子的質(zhì)量問(wèn)題吧或者是不是鋪板時(shí)候的細(xì)胞密度太低了？我用的corning的板 。
一個(gè)好辦法：在你培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和后再取出，種入細(xì)胞時(shí)力量要輕，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細(xì)胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長(zhǎng)。記住千萬(wàn)不要用振蕩器振蕩，否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說(shuō)得那樣聚積在一起。
我今天把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個(gè)小時(shí)，適當(dāng)?shù)陌鸭?xì)胞密度加大了一下，另外多加了一點(diǎn)培養(yǎng)液，今晚看細(xì)胞鋪的挺好的。我認(rèn)為有兩種可能解決你問(wèn)題的辦法:1.加入前吹打均勻;2.從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入。
問(wèn)：我在做原代培養(yǎng)時(shí)也遇到過(guò)這種情況，我一直以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象，因?yàn)榛靹虻难芏渭尤氲脚囵B(yǎng)皿中時(shí)，在相差顯微鏡下血管段均勻分布在培養(yǎng)皿中，24h后貼壁的血管段就是周邊多，中間相對(duì)少些。下次我要試試hkqu戰(zhàn)友的方法看能否改變這種現(xiàn)象。
答：這種現(xiàn)象很正常呀，不知你仔細(xì)觀察過(guò)沒(méi)有，孔直徑愈小，這個(gè)現(xiàn)象越明顯，我試過(guò)，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免，因?yàn)橐后w的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個(gè)液平面，而是周邊高，就像凹鏡一樣，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液，使得細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話，這要看你需要觀察何種指標(biāo)，如果是MTT
，免疫組化的話會(huì)因?yàn)榧?xì)胞成層而影響結(jié)果。
(5)6孔板接種和換液?jiǎn)栴}：
問(wèn)：我的細(xì)胞傳代很正常，但一種到六孔板里（不管加藥和對(duì)照），總有兩三個(gè)孔（隨機(jī)）細(xì)胞長(zhǎng)得不好，很小，像破碎了。有人遇到過(guò)這種情況嗎？到底是啥原因呢？請(qǐng)各位指點(diǎn)
答：可能跟你加液的溫度有關(guān)。如果你細(xì)胞剛剛拿出來(lái)?yè)Q液加液，培養(yǎng)基也是從4度冰箱拿出來(lái)不久，很容易細(xì)胞就會(huì)凍死了。建議你最好把培養(yǎng)基先在培養(yǎng)箱里邊孵育15min先。
另外，跟你細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也有關(guān)。加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培養(yǎng)。保證細(xì)胞狀態(tài)良好。
或者放在37度水浴鍋里孵育也可以，或者是培養(yǎng)板本身的問(wèn)題，你再換換其它培養(yǎng)板試試看。再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問(wèn)題了，種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下
問(wèn)：最近幾天，我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，在更換培養(yǎng)基之前，顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁，狀態(tài)非常的好，更換了培養(yǎng)基后，立即用顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài)。細(xì)胞變得非常小，產(chǎn)生大量的碎片，而另一半的細(xì)胞一切正常，異常細(xì)胞與正常細(xì)胞之間存在一條分水嶺，上半個(gè)圓是好的，下半個(gè)圓就不好，這是怎么一回事？
答：你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒(méi)放水平。有一回我也出現(xiàn)過(guò)這種情況。
你的培養(yǎng)液如何，如果培養(yǎng)液過(guò)期，細(xì)胞就不會(huì)貼壁。換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液試一試。
我也經(jīng)常碰到，我想可能是板的問(wèn)題，換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒(méi)問(wèn)題了。
不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多，換培養(yǎng)基的時(shí)候如果沒(méi)有注意風(fēng)機(jī)的影響，特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí)，容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂。如果如此，換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行，別怕浪費(fèi)吸管，注意操作的效率！
(6)24孔板接種問(wèn)題：
問(wèn)：把細(xì)胞消化接種到24孔板之后，已經(jīng)四天了，老是每孔的中間部分長(zhǎng)不滿，每天換液時(shí)都用PBS 清洗，第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況，每孔的邊緣長(zhǎng)的很好，中央大量死細(xì)胞？
答：我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片，在玻片上種植。每次換液都用PBS洗，必要的步驟嗎？另外，也有可能和細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān)？
我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了。由于表面張力的作用，培養(yǎng)板的邊緣液體會(huì)向上走，造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個(gè)凹面（就像量筒的液體凹面一樣），中央的細(xì)胞正好在凹面的最低處，培養(yǎng)液少，細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)不夠，甚至干涸掉，空氣中的氧氣也會(huì)造成損傷，即使有增值過(guò)來(lái)的細(xì)胞也會(huì)死掉。
另外，檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了，如果少了，箱內(nèi)的空氣濕度不夠，會(huì)造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快，這樣即使剛加的液體不少，過(guò)一段時(shí)間，由于蒸發(fā)，液體量會(huì)減少，造成中央干涸。并且這樣會(huì)改變了培養(yǎng)液的成分濃度，造成滲透壓過(guò)高。
個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問(wèn)題:24孔板小，細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況.至于中間較多死細(xì)胞，如果是懸浮狀的話，也一樣是物理問(wèn)題。接種后比較粗暴的碰撞，似乎對(duì)搖均勻細(xì)胞有一定效果.
在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)一定要注意，不要把培養(yǎng)基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成細(xì)胞干涸，這樣的話細(xì)胞會(huì)很快死亡。我有一段時(shí)間總是遇到這個(gè)問(wèn)題，一個(gè)板子中總有一兩個(gè)孔出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是上面的原因。現(xiàn)在我做的時(shí)候如果必須把液體吸干，我會(huì)一個(gè)一個(gè)空來(lái)吸取，最多一次不超過(guò)3孔，然后馬上加入液體，同時(shí)在作轉(zhuǎn)染時(shí)，我會(huì)在吸液和加液時(shí)將風(fēng)機(jī)關(guān)掉，這樣基本上會(huì)避免細(xì)胞死亡。
同時(shí)你所說(shuō)的細(xì)胞周?chē)芏虚g稀疏，大約有如下原因：
1.培養(yǎng)液加得太少。主要是由于液體張力的問(wèn)題。
2.細(xì)胞接種后震蕩太厲害了。由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周?chē)?br>
細(xì)胞分布均勻與否有一點(diǎn)很關(guān)鍵，即每種細(xì)胞是有個(gè)體差異的，別人的細(xì)胞操作不一定適合于你.所以要靠自己摸索，且找出專(zhuān)屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律，有如下經(jīng)驗(yàn)：
1.所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻。
2.按資料記載，24孔板的液體量為1ml，個(gè)人也覺(jué)得1ml的量足矣。
3.接種時(shí)，要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭，這樣做對(duì)細(xì)胞均勻分布有一定效果。
4.接種后最好直接放入培養(yǎng)箱讓細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)板這個(gè)新的環(huán)境，個(gè)人認(rèn)為沒(méi)有必要在室溫放置一段時(shí)間。
5.根據(jù)細(xì)胞的特性，細(xì)胞均喜歡聚集在邊緣生長(zhǎng)，所以我考慮到，你的問(wèn)題還有可能是接種時(shí)的細(xì)胞密度不夠，導(dǎo)致周邊密集，中間稀疏的錯(cuò)覺(jué)。你的拌種密度是多少？
另"要慢慢加樣，且記得輕微旋轉(zhuǎn)槍頭"的意思就是:加樣不能太快，避免細(xì)胞在一個(gè)加樣處聚集，且注意在不同的部位進(jìn)行加樣，即邊加邊活動(dòng)槍頭，人為使細(xì)胞趨于均勻分布，我個(gè)人覺(jué)得有一定的效果，不知這次我解釋清楚沒(méi)有。
