茚三酮與谷氨酸的顯色反應靈敏度較高 ,但同時也受到多種因素的影響。

當實驗條件控制不好時 ,會造成實驗數據的較大偏離 ,從而產生較大的誤差。此顯色反應的影響因素主要有以下幾方面。

谷氨酸濃度的影響

實驗表明 ,谷氨酸與茚三酮水溶液在表 3所注條件下反應的最低顯色濃度為70μg/ mL 。隨谷氨酸濃度變大 ,顯色逐漸變深。當濃度大于 140μg/ mL 時 ,所顯顏色過深且其光密度值超出量程。當谷氨酸濃度在 80～140μg/ mL時 ,顏色變化明顯且顯色較穩定。

注 :90 ℃下水浴 25 min ,谷氨酸標準液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL ,p H6. 0。

pH 值的影響

以 100μg/ mL 的谷氨酸標準液在不同pH下進行顯色反應 ,測得結果如表 。

注 :90 ℃下水浴 25 min ,谷氨酸標準液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL

由表 2可見 ,顯色反應隨 pH的不同顏色有明顯的變化。當 pH在 4 以下時不顯色 ,而 pH 在 6～10 時 ,顏色變化明顯。但因茚三酮的水溶液在堿性條件下溶液本身帶有明顯的淡黃色 ,因此 pH選定在 6 左右較好 ,此時基本無顏色干擾且顯色穩定。?

溫度及反應時間的影響

實驗表明 ,溫度和反應時間對此顯色反應的影響也很大。以 100μg/ mL 的谷氨酸標準液在 70 ℃進行顯色發應時 ,發現即使加熱30 min 也基本無顏色變化。當溫度為 80 ℃時 ,加熱 30 min 以上有顏色變化 ,而當溫度為 90 ℃時 ,加熱 15 min 左右即有明顯的顏色變化 ,沸水加熱時顏色變化也很明顯。但考慮到蒸發的影響 ,所以實驗選用 90 ℃作為最佳反應溫度。在顯色反應中 ,反應時間主要根據具體的顏色變化而定。一般來說 ,當谷氨酸濃度在 80～140μg/ mL 時 ,90 ℃加熱 20 min 以上即可完全反應。時間太短 ,反應不完全 ,顏色梯度不明顯 , 所以最佳反應時間在 20 ～25 min。

注 :谷氨酸標準液 5mL ,茚三酮水溶液 1mL 。

其它影響因素

茚三酮的不同溶劑對顯色反應也有影響。實驗表明 ,茚三酮的丙酮溶液在 80 ℃以上時顯色較好 ,而茚三酮的水溶液要在 90 ℃以上時顯色才明顯。茚三酮的用量對顯色反應的影響不大 ,可選擇 5mL (或 3mL) 被測液與 1mL (或 0. 5 mL) 茚三酮溶液反應。測定時 ,最好選擇谷氨酸標準樣與待測稀釋液一同水浴 ,這樣可提高測定的準確度。此外 ,當被測樣品中含有其它氨基酸時也可與茚三酮發生顯色反應 ,從而影響測定結果。但在谷氨酸發酵中 ,所產的谷氨酸含量一般是其它氨基酸的幾十倍 ,故此影響因素可忽略不計。

總之 ,茚三酮比色法作為一種谷氨酸的定量檢測方法 ,具有操作簡單、成本低的優點。只要控制好實驗條件 ,就能取得較好的測量結果。這對于一般實驗室的樣品分析及味精生產廠家的谷氨酸產品測定 ,有較好的實用價值。