細胞凍存的操作要點（四）
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??低溫凍存技巧???
冷凍凝固的過程中，水分會在0℃~-20℃區間形成不同形狀的結晶
在細胞凍存時“降溫速度、冰晶形成量和細胞滲透壓改變程度”是凍存成功與否的重要關鍵。
降溫速度慢：冰晶由細胞外開始形成，造成胞外滲透壓變小，細胞內水份移動至細胞外造成細胞脫水。
降溫速度快：水分流動時間短，細胞內外滲透壓改變程度小，但大量水分留在細胞內造成大量胞內冰晶形成，使得胞器損壞。
這些都可能引起細胞損傷、凋亡或壞死，也可能造成復蘇后細胞存活率低、細胞形態改變、細胞功能喪失、基因變異等現象。
由此可知，最適合的凍存條件為“在增加細胞滲透壓穩定性的溶液中，以慢到能減少胞內冰晶形成，但也足夠快到能預防細胞脫水的降溫速度凍存細胞”。
慢凍快融
1. 慢凍→兩種辦法：
手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般最廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器，使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。
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程序降溫 |
手動降溫 |
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優點 |
主動監控溫度 一些控制速率的冷凍機不需要任何可消耗的制冷劑 |
不需要任何特殊器皿 成本低 |
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要求 |
受控速率凍結裝置 適當的存儲瓶 專門的冷凍溶液 |
專門的冷凍溶液 -80℃冷凍機 液氮罐 |
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長時間保存 |
液氮或低溫儲存（只要低于-135℃即可） |
液氮 |
由此可以看出，程序降溫精準度更高，優于手動降溫。大家可以根據實驗條件選擇不同的凍存方式。
2. 快融：
將凍存在液氮中的細胞凍存管快速移至已37℃預熱的水浴鍋中（水面需低于管口，避免水分意外進入凍存管造成潛在污染），使細胞冷凍懸液迅速融化；此做法能讓細胞冷凍懸液快速通過-20℃~0℃這個結晶形成溫度范圍，避免冰晶進入細胞形成再結晶，對細胞造成二次傷害。
FAQ
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問 題 |
建 議 |
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有毒的冷凍保存液 |
根據制造商的說明使用商業上可獲得的和定義的介質。解凍后立即取出冷凍保護劑。避免細胞在室溫中置于低溫保護介質中。 |
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不適當的冷卻速率 |
使用-1℃/min的逐漸冷卻速度。要達到這個速度，可以使用保溫的冷凍容器或控制速度的冷凍機。 |
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冷凍后的溫度變化 |
保持細胞在-130℃后的低溫。運輸時要將細胞放在干冰上，并確保液氮中有充足的液氮。 |
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不當的解凍速率 |
細胞必須迅速解凍，使用37℃的水浴解凍凍存管。 |
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不正確的細胞密度 |
根據不同的細胞類型選擇凍存的細胞密度。典型的細胞密度凍存密度是1-10*106cells/ml。 必要的話，要進行細胞最佳凍存密度測試。 |
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Reference??
1. Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015).
2.? Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE.
3.? Baust J., 2007; Van Buskirk, 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015; Allegrucci & Young.
4. Data Acknowledgment: Prof. Shirley H.J. Mei and research team Yuan Tan and Mahmoud Salkhordeh, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hosptoal Research Institute(Ottawa, Canada).
