材料、設(shè)備及試劑
　　一、 材料
　　外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知; 載體DNA: T-vector(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。
　　二、 設(shè)備
　　恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf管。

　　三、 試劑
　　1、連接反應(yīng)緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產(chǎn)品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。
　　2、T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。
　　3、X-gal儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。
　　4、IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。
　　5、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。
　? 操作步驟
　　一、 連接反應(yīng)
　　1、取新的經(jīng)滅菌處理的0.5ml eppendorf管, 編號。
　　2、將0.1μg載體DNA轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。
　　3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。
　　4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24小時。
　　同時做二組對照反應(yīng)，其中對照組一只有質(zhì)粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質(zhì)粒載體。
　　二、 E. coli DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化
　　1、從-70℃冰箱中取200μl感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
　　2、 加入連接產(chǎn)物溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。
　　3、42℃水浴中熱擊90秒或37℃水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。
　　4、向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時,使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
　　5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37℃培養(yǎng)16-24小時。
　　同時做兩個對照:
　　對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。
　　對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。

　　統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。
　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：
　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積
　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)
　　感受態(tài)細胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積
　　感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù)
　　[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。有的轉(zhuǎn)化效率高，需將轉(zhuǎn)化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉(zhuǎn)化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉(zhuǎn)化率。
　　三、 重組質(zhì)粒的篩選
　　1、每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時以上,直至液體被完全吸收。
　　2、倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時,待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。
　　3、放于4℃數(shù)小時,使顯色完全（此步LB培養(yǎng)基不做）。
　　不帶有T-vectorDNA的細胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有T-vector的空載體的轉(zhuǎn)化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在X-gal和ITPG培養(yǎng)基上為藍色菌落；帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal和ITPG培養(yǎng)基上為白色菌落。
　　四、 酶切鑒定重組質(zhì)粒
　　用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時。使用煮沸法快速分離質(zhì)粒DNA直接電泳，同時以煮沸法抽提的T-vector做對照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時遷移率較T-vector慢。再用與連接未端相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質(zhì)粒。
　　[注意] 1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。
　　2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。
　　3、連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲存數(shù)天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉(zhuǎn)化效率。
　　4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。
　　5、在連接反應(yīng)中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機會。
　　6、LB選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養(yǎng)時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。
　　7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達。
　　8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍色菌落明顯。