范杰課題組/王琦課題組沸石表面構建新的人工凝血途徑
背景介紹
生物細胞表面限域的酶具有穩定、高效和空間可控的特點，調控生物體內各種各樣的化學反應，如酶原激活、血液凝固及纖維蛋白凝塊溶解。凝血反應途徑是經典的體內表面限域酶反應之一。凝血反應途徑包含13種凝血因子，涉及血小板表面凝血因子的活化，最終剪切纖維蛋白原以形成血凝塊。其中，關鍵的反應是凝血酶原轉化為凝血酶，有效的凝血酶形成需要凝血因子Xa與輔助因子Va在活化血小板表面組成凝血酶原復合物。任何凝血因子的缺乏或者降低，都會導致自然凝血途徑的激活效率低。受自然界的啟發，但不受自然界的束縛，研發人員構建了一套體外凝血系統不僅能夠模仿自然凝血過程，同時提供更有效的促凝血效率，可用于血友病和大出血患者的有效止血。
成果簡介
在自然凝血途徑中，凝血系統中有一類重要維生素K依賴的凝血因子酶原，它們均具有相似的蛋白質結構域，羧基端都由絲氨酸蛋白酶結構域構成。凝血因子酶原需要上游活化的凝血因子激活，才能暴露具有活性的催化部位，繼續激活下游的凝血因子酶原。凝血因子酶原都是具有胰蛋白酶結構域的前體，典型代表有凝血酶原和凝血因子X。如果能直接利用低成本且廣泛使用的胰蛋白酶活化凝血途徑的凝血因子，將大大縮短凝血級聯反應。鑒于此，浙江大學范杰和王琦研究團隊利用沸石分子篩納米孔道與胰蛋白酶氨基酸殘基的相互作用，通過表面限域構建胰蛋白酶/沸石復合物（即構建高效人工凝血催化系統），直接激活凝血酶原形成凝血酶。這種人工凝血催化系統充當了凝血酶原酶復合體的作用，簡化了凝血酶原激活反應前的級聯酶反應，降低反應凝血因子量的需求，減少纖維蛋白交聯體血凝塊形成的時間。
沸石表面人工凝血催化系統的有效構建，關鍵在于胰蛋白酶在其表面的微觀結構及酶活力調控。研究團隊利用沸石分子篩的陰離子骨架結構及表面金屬離子分布，實現被限域的胰蛋白酶在沸石分子篩的結合區域、活性位點的暴露程度和空間取向的調控。通過蛋白質二甲基標記技術及分子動力學模擬方法，驗證了CaY沸石表面可調控胰蛋白酶的底物結合口袋以40o角度暴露在溶液體系中，增加與凝血酶原的結合概率，可以進一步增強自然凝血途徑的激活效率，從而提升促凝血系統的催化性能。相反，NaY沸石表面可調控胰蛋白酶的底物結合口袋以160o角度朝向沸石表面，增加與凝血酶原的結合空間位阻，降低促凝系統的催化性能。
該人工凝血催化系統，在血友病老鼠斷尾出血模型和兔子股動脈致死大出血模型中均具有顯著的止血功能。沸石表面胰蛋白酶的人工凝血催化系統表現出優異的止血性能、良好的儲存穩定性，使其有望成為一種高效、實用的止血材料，為血友病和大出血患者提供有效的保護。
