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基于 neofleX 質(zhì)譜儀的空間多組學(xué)解決方案
前言
空間組學(xué)是繼蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)之后、一門新興的分子維度表征技術(shù)，用于探索生物分子與機(jī)體之間的關(guān)系。MALDI質(zhì)譜成像作為一種免標(biāo)記、高靈敏度、在組織原位實(shí)現(xiàn)分子檢測(cè)的表征手段，通過(guò)與其他的多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物/植物組織和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和內(nèi)/ 外源性代謝物的種類、含量和空間分布的精準(zhǔn)測(cè)定，經(jīng)過(guò)研究人員不斷地豐富與發(fā)展，逐漸形成了“MALDI成像-空間多組學(xué)”綜合性分析策略。
布魯克公司于今年的ASMS會(huì)議上推出了一款全新的、MALDI成像質(zhì)譜儀 –— neofleX? MALDI TOF/TOF。neofleX?專為質(zhì)譜成像而設(shè)計(jì)，采用布魯克頂配的smartbeam 3D激光器，保證了高靈敏的 “方形像素點(diǎn)”MALDI成像采集能力，同時(shí)配備了全新的增強(qiáng)型成像檢測(cè)器，可實(shí)現(xiàn)持久穩(wěn)定、高可重現(xiàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集性能。neofleX?還配備了多分子維度空間組學(xué)解決方案，可實(shí)現(xiàn)組織內(nèi)靶標(biāo)蛋白質(zhì)、聚糖分子、代謝物、脂質(zhì)、內(nèi)源性多肽、外源性分子、以及RNA/DNA的MALDI成像空間表征，以實(shí)現(xiàn)每一幀像素分子信息的最大化。
在本實(shí)驗(yàn)中，我們將從一塊結(jié)直腸癌樣本出發(fā)，通過(guò)neofleX?獲取脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等多種分子的空間表達(dá)譜，并將其與組織形態(tài)學(xué)圖譜相匹配，進(jìn)而獲取了跨技術(shù)維度的整合信息。
圖1: 空間多組學(xué)分析流程（多分子維度 & 多模態(tài)整合）
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實(shí)驗(yàn)部分
experiment
將收集到的人結(jié)直腸癌樣本制備成厚度為10μm的切片，隨后附著到IntelliSlides?導(dǎo)電載玻片上。利用HTX M3+基質(zhì)噴涂?jī)x噴涂DHB基質(zhì)，通過(guò)neofleX? MALDI TOF/TOF進(jìn)行正離子模式的MALDI成像數(shù)據(jù)采集。質(zhì)量范圍是m/z 500-1100，raster width采用20μm。采集前利用紅磷標(biāo)品進(jìn)行儀器校準(zhǔn)， 采集中開(kāi)啟“online calibration”功能模塊、依據(jù)已知的內(nèi)源性脂質(zhì)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)在線校準(zhǔn)。對(duì)結(jié)直腸癌樣本切片實(shí)施MALDI HiPLEX-IHC工作流程，采用了14通道質(zhì)量標(biāo)簽用于抗體染色（圖3給出了部分靶標(biāo)蛋白質(zhì)的成像結(jié)果）。MALDI成像產(chǎn)生的OME-TIFF文件直接導(dǎo)入到SCiLS? Scope軟件中以實(shí)現(xiàn)空間可視化分析。MALDI成像后的切片經(jīng)過(guò)H&E染色后，置于Hamamatsu nanozoomer之下以獲得高清的顯微圖片?？臻g多組學(xué)與多技術(shù)模態(tài)的數(shù)據(jù)整合、統(tǒng)計(jì)分析及空間可視化呈現(xiàn)均在SCiLS? Lab 2024b軟件中完成。
結(jié)果與討論
result & discussion
圖2中的兩個(gè)列表為正離子模式下、MALDI成像所獲得的脂質(zhì)分子信號(hào)及相應(yīng)的分子注釋結(jié)果，包括質(zhì)荷比、脂質(zhì)的名字、離子加合形式及相應(yīng)的分子式。所有的分子注釋結(jié)果均經(jīng)過(guò)了高分辨timsTOF fleX質(zhì)譜儀一級(jí)譜圖及二級(jí)譜圖的驗(yàn)證。圖2右展示了三個(gè)脂質(zhì)分子PC 30:0、PC 32:0和SM 40:1;O2的離子成像熱圖?？梢钥吹?，三個(gè)分子在結(jié)直腸癌樣本切片上具有顯著的差異性空間分布。
圖2:?MALDI成像實(shí)驗(yàn)獲得的脂質(zhì)分子注釋結(jié)果及三個(gè)代表性脂質(zhì)的離子成像熱圖
圖3A為SCiLS? Lab 2024b所展示的多模態(tài)成像數(shù)據(jù)的多重疊加圖片（overlay）。藍(lán)色通道代表脂質(zhì)分子PC 30:0；黃色通道代表CD68，作為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，它可以描繪出免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)區(qū)域；紅色代表PanCK（腫瘤的標(biāo)志物），用以描繪腫瘤區(qū)域。疊加圖的最底層為H&E染色圖片。通過(guò)調(diào)整上述各個(gè)顏色通道的“空間表達(dá)強(qiáng)度”，可以同時(shí)呈現(xiàn)出多種類型分子在病理區(qū)域的空間表達(dá)特征及潛在的共定位關(guān)系，從而找出它們?cè)诳臻g上的關(guān)聯(lián)性。圖3B、3C為局部放大圖，與圖3B相比，圖3C采用了90%的透明度，將分子的“空間表達(dá)”部分地隱藏起來(lái)，這樣可以更好地查看組織的形態(tài)學(xué)特征。對(duì)比圖3B與圖3C，可進(jìn)一步觀察上述分子在空間表達(dá)上與特征組織微區(qū)的相對(duì)位置關(guān)系，從而揭示其背后“隱藏”的生物學(xué)意義。
圖3：結(jié)直腸癌樣本的脂質(zhì)成像、雙通道靶標(biāo)蛋白質(zhì)成像及H&E染色圖片在SCiLS Lab 2024b中的整合分析結(jié)果。
圖4為亞鐵血紅素（Heme）成像熱圖、肌動(dòng)蛋白質(zhì)（Actin-alphaSM）成像熱圖與H&E染色結(jié)果的三重疊加圖片。圖片經(jīng)過(guò)40-倍放大，可以清晰地呈現(xiàn)出血管的截面。紅色代表亞鐵血紅素分子，集中地分布于血管的內(nèi)部；綠色代表肌動(dòng)蛋白質(zhì)分子，主要分布于血管的外壁。
圖4：結(jié)直腸癌樣本多模態(tài)成像數(shù)據(jù)的40-倍放大圖片。
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結(jié)論
conclusion
布魯克的neofleX? MALDI TOF/TOF空間成像質(zhì)譜儀具有頂級(jí)的激光器及增強(qiáng)型檢測(cè)器配置，專為MALDI成像-空間多組學(xué)而設(shè)計(jì)。與多模態(tài)成像技術(shù)相結(jié)合，將空間蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與脂質(zhì)分子成像結(jié)果及H&E染色的空間特征信息相結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了跨分子尺度、跨技術(shù)維度的綜合性空間成像分析。本實(shí)驗(yàn)作為將空間多組學(xué)與多模態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)的技術(shù)探索，希望它能成為空間生物學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的補(bǔ)充工具。
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