耐藥質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化實驗
耐藥質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化實驗
本實驗學(xué)習(xí)將質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)入大腸桿菌的方法及如何篩選帶有質(zhì)粒DNA的細(xì)胞克隆，即轉(zhuǎn)化子。
【原理】
受體菌Ecoli RRI 在低溫條件下經(jīng)Ca++ 處理，可改變細(xì)胞膜的通透性，利于受體菌對DNA的攝取，這種經(jīng)Ca++ 處理的細(xì)菌稱感受態(tài)菌。pBR322 質(zhì)粒帶有氨基芐青霉素（Ap）和四環(huán)素（Tc）基因，如將pBR322質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到對上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌體內(nèi)，則可使該細(xì)菌獲得Apr和Tcr，表現(xiàn)出對Ap和Tc的抗藥性。
（一）感受態(tài)菌的制備
【材料】?
1．菌株 E.coli RRI?
2．LB 液體培養(yǎng)基?
3．75mM Cacl2?
4．其它：滅菌小試管、刻度吸管、微量加樣器、離心機(jī)?
【方法】?
1．將細(xì)菌接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16~20h。
2．取新鮮菌液，按1/100的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2~3h。
3．取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,離心5min，棄上清。
4．菌體沉淀加入750μl預(yù)冷的（4℃）75mmol/L CaCL2 溶液，輕輕吹打菌懸液，放冰浴30min。
5．4℃3000rpm/min,離心5min，棄上清。?
6．菌體沉淀加入200微升預(yù)冷的75mmol/LCaCL2溶液，冰浴4min以上。4℃保存?zhèn)溆谩?span id="zp7x9nz" class="Apple-converted-space">?
（二）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化?
【材料】?
1．pBR322 質(zhì)粒DNA,?
2．感受態(tài)菌75mmol CaCl2?
3．LB肉湯培養(yǎng)基，無藥LB瓊脂平板，氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）?
4．其它：滅菌小試管，L形玻璃棒?
【方法】?
1. 取2個潔凈，滅菌的EP管，按表10－2加入各成分： ?
2. 上述2個試管充分混均勻后，置冰浴30min。?
3. 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
4. 加入1ml LB肉湯培養(yǎng)基，37℃靜止培養(yǎng)1h。
（三）轉(zhuǎn)化子篩選：
1．取實驗組培養(yǎng)菌液涂布在氨芐青霉素瓊脂平板（50ug/ml）上，對照組菌液分別涂布在無藥LB瓊脂平板和氨芐青霉素瓊脂平板上，每塊板涂0.1ml，用滅菌L形玻璃棒涂勻。將涂好的平板置370C培養(yǎng)過夜，觀察轉(zhuǎn)化結(jié)果。
2．E.coli 受體菌不含有質(zhì)粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培養(yǎng)基中不能生長,若實驗組在含Ap和Tc的平板上出現(xiàn)菌落，可初步確定受體菌獲得了耐藥性質(zhì)粒，然后再通過提取質(zhì)粒DNA進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化子。
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