新抗新冠病毒藥物潛在作用靶點—新冠病毒包膜蛋白
新冠病毒已經感染超過1.5億人次，并導致300多萬人死亡，然而迄今尚無用于新冠肺炎的特效藥物。新靶點的發現和確證對于抗新冠病毒藥物研發具有重要意義。
2021年6月10日，中科院上海藥物所高召兵、李佳、沈敬山，以及武漢病毒所張磊砢、昆明動物所鄭永唐聯合研究團隊在Cell Research 發表了題為SARS-CoV-2 envelope protein causes acute respiratory distress syndrome (ARDS)-like pathological damage and constitutes an antiviral target 的研究論文，報道了一個新抗新冠病毒藥物潛在作用靶點—新冠病毒包膜蛋白（SARS-CoV-2 envelope protein，2-E）通道。該論文首先證明了新冠病毒包膜蛋白可形成一種酸敏感陽離子通道，且實驗顯示該通道本身可導致細胞死亡、促進炎癥因子釋放及小鼠ARDS樣損傷，進而通過活性篩選與結構優化發現了多個在動物模型上兼有預防和治療作用的小分子通道抑制劑。值得指出的是，疫情暴發伊始，研究團隊即開展聯合攻關，并基于其在離子通道和病毒研究方面的積累，很快證明了包膜蛋白形成離子通道并具有成為新型藥物作用靶點的潛力，于2020年6月以預印本形式發表了部分工作。
包膜蛋白2-E形成新型陽離子通道
新冠病毒包含刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)共4個結構蛋白。包膜蛋白（E）是其中最小的結構蛋白，長約75個氨基酸，其蛋白本質和生理病理功能尚不明確。其它冠狀病毒E蛋白的研究顯示該類蛋白具有離子通道活性，但將其作為干預靶點的研究較少報導。
該研究中高召兵研究團隊與合作者將純化的包膜蛋白2-E重組于人工脂質雙分子層上，首次獲得了由2-E介導的單通道電流，證實其為離子通道；通過改變記錄的內外液條件，發現2-E通道為陽離子通道，可以通透單價陽離子鉀、鈉和二價陽離子鈣、鎂；采用同時改變內外液pH并結合質子滴定的方法，首次證實隨著內外液pH值的降低，2-E通道電導與開放概率逐漸升高，通道活性增強。以上結果表明，SARS-CoV-2-E能夠形成pH值敏感的非選擇性陽離子通道。值得指出的是，有研究發現新冠病毒可通過酸化溶酶體、改變酶活性從而從胞內釋放；在感染新冠病毒的重癥患者體內，也存在嚴重的離子失衡，與包膜蛋白2-E蛋白形成酸敏感離子通道可能具有一定關聯性。
包膜蛋白2-E通道誘發宿主細胞死亡與體內炎癥風暴
新冠病毒感染患者體內發生細胞因子風暴，出現肺泡損傷、水腫、出血、間質炎性浸潤，重癥患者會出現急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。在細胞水平，研究團隊通過在不同種屬來源與不同類別的細胞系中表達2-E通道，發現其通道功能可誘導宿主細胞發生死亡；通過2-E直接表達、2-E蛋白刺激以及巨噬細胞共培養的方式發現2-E通道蛋白可誘發體外炎癥分泌。進一步研究顯示，2-E蛋白在小鼠體內可誘導TNF-α、IL-6以及趨化因子CXCL9、CCL12的表達水平顯著上升，以及肺組織發生ARDS樣損傷，與COVID-19患者體內所觀察到的現象具有一些相似性。
包膜蛋白2-E通道參與SARS-CoV-2病毒復制
研究團隊采用丙氨酸突變掃描技術，發現了兩個顯性負突變2-EF4A與2-ET11A。與野生型2-E對比，這兩個突變通道活性較低；轉染細胞后發現，突變組的病毒基因拷貝數顯著降低；體內外給予突變通道蛋白，其導致的炎癥因子釋放和ARDS樣損傷亦顯著降低。以上結果顯示包膜蛋白2-E的通道活性在SARS-CoV-2病毒組裝和釋放以及引起宿主損傷過程中發揮重要作用。
包膜蛋白2-E通道抑制劑在動物模型上可預防和治療SARS-CoV-2感染
依托上海藥物所離子通道研究平臺研究團隊開展了通道抑制劑的篩選和發現工作，從數千種老藥、天然產物中挑選出BE系列化合物進行深入研究。實驗結果表明，BE系列化合物在通道抑制活性、細胞保護作用和抗病毒活性方面有著較好的正相關性，從而支持了BE系列化合物是通過抑制2-E的通道活性來發揮細胞保護以及抗病毒作用的觀點。綜合考慮體外活性、代謝性質和毒性評價結果，研究團隊選擇BE-33作為候選化合物，通過預防和治療給藥2種方式考察該化合物的體內抗病毒作用。將BE-33以尾靜脈注射的方式給予人血管緊張素轉換酶-2（hACE-2）轉基因小鼠，分別在感染后的第1天及第3天，解剖小鼠并觀察小鼠器官的病理變化，期間采用qRT-PCR的方法檢測小鼠體內SARS-CoV-2的復制情況。結果顯示，接受BE-33預防給藥/治療給藥的小鼠與對照組小鼠相比，其肺部病毒RNA水平在第1天和第3天均有下降的趨勢。此外，尸檢顯示對照組小鼠的下呼吸道出現不同程度的水腫、出血，提示其發生間質性肺炎，而BE-33可以緩解這些癥狀。同時評估感染小鼠體內炎癥，結果發現BE-33組小鼠的炎癥細胞因子和趨化因子水平明顯低于感染小鼠。上述實驗結果說明，BE-33在預防給藥組以及治療給藥組均展現了良好的效果，尤其在治療給藥組中展現了優良的抗病毒作用。文獻調研結果也顯示，這是為數不多的在動物水平預防和治療性給藥均有效的化合物。
綜上所述，高召兵/沈敬山/李佳/張磊砢/鄭永唐聯合研究團隊發現并首次證明了新冠病毒包膜蛋白可形成離子通道，闡釋了其可能介導的生理和病理功能，并發現了在動物水平兼具預防與治療SARS-CoV-2感染作用的小分子通道抑制劑。這項工作為抗新冠病毒藥物研發提供了潛在新靶點，同時發現了具有潛力的抗新冠病毒新藥候選化合物。該項研究工作還提示，以離子通道為靶點開展抗擊包括新冠病毒在內的突發病毒感染藥物研發具有重要價值。
上海藥物所夏冰清副研究員、博士生申許瑞、何洋副研究員，以及武漢病毒所潘曉彥副研究員、昆明動物所劉豐亮副研究員為該論文的共同第一作者。上海藥物所高召兵研究員、李佳研究員、沈敬山研究員，以及武漢病毒所張磊砢副研究員、昆明動物所鄭永唐研究員為共同通訊作者。研究工作同時得到了上海藥物所蔣華良院士、周虎研究員、程曦副研究員以及武漢病毒所肖庚富研究員的支持和幫助。共同作者還包括該聯合研究團隊其它成員。
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